Performance Comparison of Binary Ultra High Performance Liquid Chromatography Systems from Multiple Vendors for Methods Which Utilize Long, Shallow Gradients

Význam tématu

Longé a mělké gradienty v reverzní fázi kapalné chromatografie jsou klíčové pro kvalitní separaci komplexních vzorků, například peptidových digestů, glykosidů nebo přírodních produktů. Vysoce přesná a reprodukovatelná tvorba gradientu zajišťuje stabilní retence analytů, usnadňuje jejich spolehlivou identifikaci a kvantifikaci a snižuje potřebu opakovaných analýz.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává výkonnost tří vysoce tlakových binárních UHPLC systémů (Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS, Vendor A a Vendor B) při tvorbě dlouhých mělkých gradientů použitých v generické metodě peptidového mapování. Hlavním cílem je kvantifikovat a porovnat reprodukovatelnost retence jednotlivých složek na základě opakovaných injekcí standardního enolázového digesčního vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: MassPREP Enolase Digestion Standard (Waters).
Chromatografické podmínky:

• LC systémy: tři binární UHPLC systémy – Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS (s aktivním předohřevem a ACQUITY UPLC TUV detektorem) a dva konkurenční (s DAD detektory).
• Kolona: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 1,7 µm, 2,1×100 mm, 65 °C.
• Mobilní fáze A: 0,1 % TFA/H2O; fáze B: 0,1 % TFA/ACN.
• Gradient: 0–88 min 1→50 % B, 88–90 min 50→90 % B, 90–102 min izokrat 90 % B, návrat 102–126 min 1 % B.
• Průtok 0,2 mL/min, objem injekce 10 µL, detekce @214 nm, snímkování 10 Hz.
• Software: Empower 3 CDS a Chromeleon 7.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro osm opakovaných injekcí byly porovnány standardní odchylky retenčních časů (RT SD) za celou šíři peptidových složek:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS: průměrná RT SD 0,012 min (0,7 s).
• Vendor A: průměrná RT SD 0,062 min (3,7 s).
• Vendor B: průměrná RT SD 0,033 min (2,0 s).

Overlay chromatogramů ukázalo u systému Waters výbornou kongruenci špiček bez výrazných posunů mezi injekcemi. Vendor A projevoval náhodné posuny a horší rozlišení kritických párů v časném gradientu, což znesnadňuje spolehlivou identifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoce precizní binární gradient:

• Podporuje robustní peptidové mapování a sledování kritických fragmentů v biopharma QA/QC.
• Umožňuje detailní analýzu glykoproteinových struktur i přírodních produktů včetně komplexních směsí.
• Zkracuje časové nároky na validaci metod a snižuje riziko chybné interpretace dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší integrace s pokročilou automatizací a umělou inteligencí pro optimalizaci gradientních profilů, další zvyšování tlaku a miniaturizace systému. Kombinace s hmotnostní spektrometrií a multiomickými přístupy rozšíří aplikační potenciál v proteomice, glykomice a metabolomice.

Závěr

Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS systém dosáhl nejlepších výkonů v oblasti retence a její reprodukovatelnosti při dlouhých mělkých gradientech, čímž minimalizuje nutnost opakovaných měření a zvyšuje spolehlivost výsledků. Doporučuje se pro aplikace vyžadující vysokou přesnost a stabilitu gradientu.

Reference

1. Swartz M, Krull I. Validation and Peptide Mapping. LCGC North America, 25 (2007) 468–475.
2. Lauber MA, Koza SM, Chambers EE. Comprehensive Characterization of the N and O-Linked Glycosylation of a Recombinant Human EPO. Waters Application Note 720005462EN, 2015.
3. Nikles S, Monschein H, Zou H, Liu Y, He X, Fan D, Lu A, Yu K, Isaac G, Bauer R. Metabolic Profiling of the Traditional Chinese Medicine Formulation Yu Ping Feng San for the Identification of Constituents Relevant for Effects on Expression of TNF-α, IFN-γ, IL-1β and IL-4 in U937 cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 145 (2017) 219–229.
4. Simeone J, Hong P, McConville P. Performance of the ACQUITY UPLC I-Class PLUS System for Methods Which Employ Long, Shallow Gradients. Waters Application Note 720006290EN, 2018.