Rapid Analysis of mRNA 5' Capping with High Resolution LC/MS

Význam tématu

Kvalita syntetizované mRNA pro vakcíny a léčebné aplikace je do značné míry dána úspěšností připojení 5′ čepičky, jež zvyšuje stabilitu molekuly a zajišťuje efektivní translaci. Stanovení poměru správně čepičkovaných oligonukleotidů představuje klíčový ukazatel kvality v procesu výroby mRNA.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlý a citlivý LC/MS postup pro kvantitativní analýzu mRNA 5′ čepičky s celkovým časem přípravy vzorku a analýzy pouhých 75 minut. Studii vedla optimalizace site-directed RNase-H štěpení mRNA v kombinaci s vysokorozlišovací LC/Q-TOF detekcí. Metody byly testovány na srovnání ko-transkripčního ARCA čepičkování a enzymatického čepičkování Vaccinia kappačním enzymem.

Použitá metodika

Analytický postup zahrnoval:

• PCR amplifikaci plazmidu s T7 promotorem a in vitro transkripci mRNA pomocí T7 RNA polymerázy.
• Precipitaci a čištění mRNA kolísáním LiCl a etanolem.
• Site-directed RNase-H štěpení s chimerickými RNA/DNA sondami (40 a 50 nukleotidů) při 50 °C za použití thermostabilního RNase-H.
• Čištění uvolněných 5′ oligonukleotidů pomocí Monarch RNA cleanup kit.
• Oddělení oligonukleotidů na AdvanceBio Oligonucleotide kolóně a detekci Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC s diodovým UV detektorem
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• AdvanceBio Oligonucleotide column (2.1×50 mm, 2.7 μm, 120 Å)
• Agilent 2100 Bioanalyzer

Hlavní výsledky a diskuse

Thermostabilní RNase-H použitý při 50 °C umožnil vynechat dlouhý krok termální annealingu, čímž se analýza zkrátila a snížilo riziko nespecifického rozštěpení. Ko-transkripční ARCA čepičkování dosáhlo 91,3 % účinnosti pro Cap 0, po následné metylaci na Cap 1 bylo 90,6 %. Použití Vaccinia enzymatického čepičkování za standardních podmínek vedlo pouze k 2,6 % Cap 0 produktu. Úprava poměru enzymu ke vstupní mRNA (0,5× a 0,25× vstupu) zvýšila účinnost čepičkování až na 32,9 %. Identifikovány byly také sekvenční varianty vzniklé přidáním ne-templatovaných G nukleotidů („slippage“) detekovatelné jako separované chromatografické píky.

Přínosy a praktické využití metody

Postup poskytuje rychlou a přesnou kvantifikaci mRNA 5′ čepičky vhodnou pro optimalizaci výrobních procesů a kontrolu kvality v biotechnologickém a farmaceutickém prostředí. Metoda je citlivá na nízké množství vzorku a flexibilní vůči různým sekvencím mRNA bez potřeby složitých afinitních sond.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat automatizaci celého workflow, rozšíření na dlouhé mRNA transkripty a analýzu dalších modifikací čepičky, jako jsou 2′-O-methylace. Integrace pokročilé datové analýzy a strojového učení by mohla zrychlit interpretaci výsledků a zvýšit reproducibilitu.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje thermostabilní RNase-H štěpení a vysokorozlišovací LC/Q-TOF analýzu pro rychlou a spolehlivou detekci 5′ čepičky mRNA. Tento přístup poskytuje cenný nástroj pro optimalizaci a QA/QC procesů v oblasti výroby mRNA vakcín a léčivých RNA molekul.

Reference

1. Hassett K.J. et al. Optimization of Lipid Nanoparticles for Intramuscular Administration of mRNA Vaccines. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 15:1–11.
2. Stepinski J. et al. Synthesis and Properties of mRNAs Containing the Novel Anti-Reverse Cap Analogues 7-methyl(3′-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3′-deoxy)GpppG. RNA, 2001, 7:1486–1495.
3. Fuchs A.L. et al. A General Method for Rapid and Cost-Efficient Large-Scale Production of 5′ Capped RNA. RNA, 2016, 22:1454–1466.
4. Lapham J. et al. Site-Specific Cleavage of Transcript RNA. Methods Enzymol, 2000, 317:132–139.
5. Beverly M. et al. Label-Free Analysis of mRNA Capping Efficiency using RNase H Probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem, 2016, 408:5021–5030.
6. AbouHaidar M.G. et al. Non-Enzymatic RNA Hydrolysis Promoted by the Combined Catalytic Activity of Buffers and Magnesium Ions. Z Naturforsch C, 1999, 54:542–548.
7. Conrad T. et al. Maximizing Transcription of Nucleic Acids with Efficient T7 Promoters. Nat Commun Biol, 2020, 3:1–8.