Workflow Automation for LC/MS: In-Solution Protein Digestion, Peptide Cleanup, and Strong Cation-Exchange Fractionation of Peptides Enabled by AssayMAP Technology

Význam tématu

Automatizace přípravy vzorků pro LC/MS hraje klíčovou roli v proteomice, neboť umožňuje zvýšení propustnosti, snížení variability a omezení potřeby manuální práce. U sofistikovaných vícefázových postupů, zahrnujících štěpení proteinů, desalting a frakcionaci, je reproducibilita kritická vzhledem k vysoké citlivosti moderních analyzátorů. Platforma AssayMAP Bravo přináší uživatelsky přívětivé prostředí, které umožňuje vývoj i škálování komplexních workflow bez nutnosti hlubokých znalostí v oblasti automatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo předvést komplexní LC/MS workflow pro „shotgun“ proteomiku s využitím AssayMAP Bravo: in-solution štěpení proteinů, reverzní fáze (C18) pro čištění peptidů a silně kationtovou výměnu (SCX) pro frakcionaci. Jako modelový vzorek posloužil lyofilizovaný E. coli proteinový lyzát. Studie měřila počet identifikovaných peptidů, účinnost frakcionace a reprodukovatelnost mezi dny i paralelními replikáty.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizace: Agilent AssayMAP Bravo s 96-syringovou hlavou, cartridges C18, SCX a Resin-Free
• Frakcionace SCX: kroková eluce buď zvyšující se koncentrací KCl (30–350 mM) nebo zvyšující se hodnotou pH (3,5 až 9,5)
• Reverzní fáze: AssayMAP C18 pro desalting
• Štěpení proteinů: in-solution digesce trypsinem při 37 °C
• LC/MS: Agilent 1290 Infinity II LC s columna AdvanceBio Peptide Mapping C18 (2,1 × 250 mm, 2,7 µm), Agilent 6550 iFunnel Q-TOF, Dual Jet Stream ionizace
• Data processing: MassHunter, Spectrum Mill, Morpheus a vlastní skripty

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow dosáhlo identifikace více než 15 000 unikátních peptidů na vzorek (100 µg proteinového lyzátu) za podmínek 1% FDR. Pomocí frakcionace podle iontové síly bylo v 6 frakcích průměrně 67,1 % peptidů zanořeno exkluzivně v jedné frakci, v případě frakcionace podle pH to bylo 64,2 %. Porovnání s nefrakcionovaným vzorkem ukázalo téměř dvojnásobný nárůst počtu distinct peptidů (7 678 vs ~15 000). Významná byla i vysoká reprodukovatelnost: CV plochy vybraných peptidů < 8 % a odchylky m/z < 8 ppm bez interních standardů. Trendy eluce (zvyšující se počet bazických zbytků i odhadované pI) odpovídají teoretickým predikcím.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní on-deck automatizace minimálně náročného na zásahy operátora
• Škálovatelné workflow od několika desítek až po stovky vzorků denně
• Flexibilní protokoly umožňují změnu klíčových parametrů (objemů, pH, složení pufrů)
• Vysoká reprodukovatelnost a preciznost kroků vede k lepší robustnosti dat
• Zvýšení proteomické pokrytí díky efektivní frakcionaci

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování automatizovaných platforem o moduly pro další typy selektivních extrakcí (aniontová výměna, HILIC), akcelerace vývoje assay pomocí integračního softwaru a pokročilých algoritmů pro návrh protokolů. Kombinace s AI-návrhem optimálních podmínek by mohla zkrátit dobu vývoje metod a zvýšit reprodukovatelnost mezi laboratořemi. Platforma AssayMAP Bravo se tak stává základem pro robustní a škálovatelnou proteomickou přípravu vzorků ve výzkumu i kvalitativní kontrole.

Závěr

Prezentované workflow demonstruje, že multistep automatizace přípravy vzorků pro LC/MS lze plně realizovat na platformě AssayMAP Bravo. Efektivní in-solution štěpení, desalting a SCX frakcionace vedly k rozsáhlé identifikaci peptidů s vysokou reprodukovatelností. Kroková frakcionace podle iontové síly i pH významně rozšiřuje proteomické pokrytí a zvyšuje citlivost detekce nízkoodstupňových proteinů. Díky modulárnímu softwarovému rozhraní a flexibilitě protokolů mohou uživatelé rychle optimalizovat nové assay a následně je bezproblémově škálovat.

Reference

• Alpert A.J., Andrews P.C. Cation-exchange chromatography of peptides on poly(2-sulfoethyl aspartamide)-silica. J. Chromatogr. 1988, 443, 85–96
• Dai J. a kol. Proteomic analysis with integrated multiple dimensional liquid chromatography/mass spectrometry based on elution of ion exchange column using pH steps. Anal. Chem. 2005, 77(18), 5793–5799
• Wenger C.D., Coon J.J. A proteomics search algorithm specifically designed for high-resolution tandem mass spectra. J. Proteome Res. 2013
• Lehninger A.L. Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York, 1982