Rapid Antibody Digestion Enabled by Automated Reversed-Phase Desalting on the Agilent AssayMAP Bravo Platform

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu bioterapeutik vyžadující rychlou a spolehlivou charakterizaci pomocí hmotnostní spektrometrie. Klasický krok trávení trypsinem bývá největší úzké hrdlo, často trvající přes noc kvůli inhibici enzymu denaturantem. Automatizované reverzní fáze odstranění denaturantu významně zrychluje trávení a urychluje rozhodovací procesy ve vývojových projektech.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout plně automatizovaný postup na platformě Agilent AssayMAP Bravo, který pomocí reverzní fáze (RP-W kazety) nahradí velikostně vylučovací chromatografii a zkrátí čas trávení protilátek na pouhou hodinu. Studie demonstrovala integraci kroků afinitní purifikace, denaturace, redukce, alkylace, odstranění denaturantu a trávení trypsinem v jediném pracovníku v čase pod osm hodin.

Použitá metodika a instrumentace

Pro automatizaci byly využity:

• Agilent AssayMAP Bravo s 96-kanálovou hlavou a AssayMAP softwarem
• Packed-bed RP-W microchromatografické kazety pro odstranění denaturantu
• Agilent 1290 Infinity a 1260 Bio-Inert LC systémy
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS s Dual Agilent Jet Stream ESI
• Affinitní PG-W kartáše pro purifikaci protein G

Vzorky denaturované 6 M guanidinem, redukované TCEP a alkylované jodacetamidem byly naneseny na kazety, promyty 0,1 % TFA a eluovány 60–70 % acetonitrilem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kapacita RP-W kazet dosahuje až 75 µg protilátek s více než 90 % návratností a CV < 5 %.
• Optimum primingového roztoku je 20 % acetonitrilu, eluce pak 60 % acetonitrilu v 0,1 % TFA.
• Vliv průtočného objemu a průtoku byl zanedbatelný až do 20 µL/min, vzorky do 1 mL lze zpracovat do jedné hodiny.
• Trypsinové trávení trvá po odstranění denaturantu 0,5–1 h místo obvyklé přes noc, přičemž dosažená otevírna 12 konzervovaných tryptických peptidů vykazuje stabilní intenzity již po 1 h.
• Celý workflow od purifikace protilátky z komplexního média až po digested peptidy připravené k LC/MS lze provést pod 8 h s CV < 10 % pro většinu peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované reverzní fáze odstranění denaturantu a rychlý trávící krok umožňují vysokoprodukční analýzu bioterapeutických protilátek s minimální pracností a vysokou reprodukovatelností. Metodu lze nasadit v odděleních kvalitativní a kvantitativní kontroly, ve výzkumných laboratořích i v procesech vývoje nových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další biologické makromolekuly, jako jsou fúzní proteiny, protilátkové fragmenty a glykoproteiny.
• Integrace s LIMS a on-line změření kvality během výrobního procesu.
• Podpora pokročilejších kazetových formátů pro multi-enzymatické trávení, obohacení glykosidických struktur či posttranslačních modifikací.
• Využití umělé inteligence k automatickému ladění protokolů a predikci optimálních podmínek pro nové proteiny.

Závěr

Automatizovaná reverzní fáze desalting na platformě AssayMAP Bravo výrazně zkracuje čas a zvyšuje reprodukovatelnost trávení protilátek. Spojením afinitní purifikace, denaturace, redukce, alkylace, desaltingu a trávení vzniká efektivní end-to-end workflow, které umožňuje přípravu vzorků pod osm hodin a usnadňuje rychlejší rozhodování ve vývoji bioterapeutik.

Reference

• Ren; et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Analytical Biochemistry 2009, 392, 12–21.
• Bovee, M.; Russell, J.; Murphy, S. Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Agilent Technologies Application Note 2014.
• Jiang, X.; et al. The effect of various S-alkylating agents on the chromatographic behavior of cysteine-containing peptides in reversed-phase chromatography. J. Chromatogr. B 2013, 915–916, 57–63.