Simultaneous quantification of peptides and phosphopeptides by capLC-ICP-MS using the Agilent 8800/8900 Triple Quadrupole ICP-MS

Význam tématu

Analytické stanovení fosforylace a obsahu síry v peptidech je klíčové pro proteomiku, klinický výzkum a farmaceutický průmysl. Použití detekce heteroatomů P a S umožňuje kvantifikaci bez potřeby izotopově značených standardů a přináší vysokou citlivost a spolehlivost i v komplexních vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat, že kapilární LC v kombinaci s Agilent 8800/8900 Triple Quadrupole ICP-MS v MS/MS mass shift módu umožňuje současnou absolutní kvantifikaci P- a S-obsažných peptidů. Studie se zaměřila na dosažení rekordně nízkých detekčních limitů, ověření efektivního odstranění interferencí a využití netypických standardů pro univerzální kalibraci.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapitální LC: Agilent 1200 capLC s kolonkou Zorbax SB C18 (150 × 0,3 mm, 5 µm), mobilní fáze A voda a B acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí, gradient od 1 do 60 % B během 3–35 min, průtok 5 µL/min, injekce 1–2 µL, vnitřní standard Ge (10 ng/mL).
• ICP-MS: Agilent 8800 Triple Quadrupole ICP-MS v MS/MS mass shift módu, Q1 předfiltruje rušivé izotopy, ORS buňka reaguje s O₂ (0,35 mL/min), do nebulizéru se přidává směs Ar/O₂ (8:2) 80 mL/min, integrační čas 150 ms pro 31P, 32S, 34S, vzorku 5 µL/min.
• Příprava standardů: Kalibrace P a S s BNPP a methioninem v rozsahu 0–200 ng/mL; modelové peptidové směsi pro určení retenčních časů a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

V prostředí 30% acetonitrilu byly detekční limity 0,6 ng/mL P a 1,2 ng/mL S. Po odečtení pozadí v chromatografickém gradientu dosáhly hodnot 0,10 ng/mL P (6,6 fmol) a 0,18 ng/mL S (11 fmol), což jsou nejnižší hlášené DL pro LC-ICP-MS. Poměr izotopů 34/32 S odpovídal teoretické hodnotě s masovým biasem –4 %, potvrzujícím účinné odstranění interferencí. U modelových peptidů byly průměrné DL 0,33 ng/mL P a 0,26 ng/mL S; odchylky od standardů lze vysvětlit šířkou chromatografických piků a karbonovým efektem na citlivost fosforu.

Přínosy a praktické využití metody

• Absolute kvantifikace fosfo- a S-peptidů bez nutnosti specifických izotopově značených standardů.
• Vysoká citlivost a selektivita díky tandemové MS/MS eliminaci interferencí.
• Aplikovatelnost v proteomice, farmaceutickém výzkumu, environmentální analýze a charakterizaci nanočástic.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení Agilent 8900 s optimalizovanou cestou plynu pro další snížení pozadí síry a fosforu.
• Integrace LC-ICP-QQQ s ESI-MS/MS pro komplexní workflow ve farmaceutické a klinické proteomice.
• Adaptace metody pro analýzu vysoce komplexních biologických, environmentálních a potravinářských vzorků.

Závěr

CapLC-ICP-QQQ v MS/MS mass shift módu dosahuje rekordně nízkých detekčních limitů pro fosfor a síru v peptidech, efektivně odstraňuje interferenční signály a umožňuje univerzální kvantifikaci bez izotopově značených standardů. Tento přístup rozšiřuje možnosti přesné kvantifikace v proteomice a dalších oblastech analytické chemie.

Reference

1. Pereira Navaza A, Ruiz Encinar J, Sanz-Medel A. Angew Chem Int Ed. 2007;46:569-571.
2. Pröfrock D, Leonhard P, Prange A. J Anal At Spectrom. 2003;18:708-713.
3. Pröfrock D, Leonard P, Ruck W, Prange A. Anal Bioanal Chem. 2005;381:194-204.
4. Smith CJ, Wilson ID, Weidolf L, Abou-Shakra F, Thomsen M. Chromatographia. 2004;59:S165-S170.
5. Wind M, Edler M, Jakubowski N, Linscheid M, Wesch H, Lehmann WD. Anal Chem. 2001;73:29-35.
6. Schaumlöffel D, Giusti P, Preud-Homme H, Szpunar J, Lobinski R. Anal Chem. 2007;79:2859-2868.
7. Pröfrock D, Leonhard P, Prange A. Anal Bioanal Chem. 2003;377:132-139.
8. Hann S, Koellensperger G, Obinger C, Furtmüller PG, Stingeder G. J Anal At Spectrom. 2004;19:74-79.
9. Stürup S, Bendahl L, Gammelgaard B. J Anal At Spectrom. 2006;21:201-203.
10. Zinn N, Hahn B, Pipkorn R, Schwarzer D, Lehmann WD. J Proteome Res. 2009;8:4870-4875.
11. Hann S, Koellensperger G, Obinger C, Furtmüller PG, Stingeder G. J Anal At Spectrom. 2004;19:74-79.
12. Zinn N, Krüger R, Leonhard P, Bettmer J. Anal Bioanal Chem. 2008;391:537-543.
13. Wind M, Wegener A, Eisenmenger A, Kelner R, Lehmann WD. Angew Chem Int Ed. 2003;42:3425-3427.
14. Clough R, Evans P, Catterick T, Evans EH. Anal Chem. 2006;78:6126-6132.
15. Becker JS. J Anal At Spectrom. 2002;17:1172-1185.
16. Mason PRD, Košler J, de Hoog JCM, Sylvester PJ, Meffan-Main S. Anal At Spectrom. 2006;21:177-186.