Absolute Quantification of Proteins in Snake Venom

Význam tématu

Proteomická analýza jedů hadů je klíčová pro pochopení mechanismu toxicity a vývoj účinných protijedů i nových léčiv. Komplexní složení jedů, bohaté na proteiny z rodin tříprstých toxinů (3FTx) a fosfolipáz A₂ (PLA₂), vyžaduje přesné kvantifikace bez dostupnosti proteinově specifických standardů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo aplikovat metodu absolutní kvantifikace intaktních proteinů založenou na kapilární LC (capLC) spojené s ICP-QQQ v MS/MS režimu a online izotopové ředění (IDA) pro analýzu jedu spitting kobry Naja mossambica. Studie demonstrovala přesnost a robustnost metody na standardních proteinech i komplexní směsi jedu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1200 capilární HPLC s BIOShell A400 C4 (150 mm×0,3 mm, 3,4 µm)
• Agilent 8800 Triple Quadrupole ICP-MS v MS/MS režimu s O₂ mass-shift metodou
• Agilent capillary LC interface kit (G3680A) pro spojení LC a ICP-MS
• Postkolonový přídavný systém s dávkovací pumpou kdScientific a ohrabovačem Spark Holland
• Autosampler, PEEK kapiláry a nulové dead-volume T-konektor

Použitá metodika

Chromatografické oddělení probíhalo v reverzní fázi (H₂O/0,2 % FA vs. AcN/0,2 % FA) při 80 °C a toku 3,5–4,5 µL/min. Po koloně se do eluátu přidávalo obohacené ³⁴S a vkládal se interní standard BOC-Met-OH. ICP-QQQ měřilo produkty SO⁺ v přechodu ³⁴S→⁵⁰ amu. Podmínky: RF 1550 W, carrier gas 0,85 L/min, O₂ cell gas 0,16 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla validována na BSA a intaktním mAb s výsledky ID masové čistoty 95 ± 5 % a 77 ± 4 %. Externí kalibrace S potvrdila podobné hodnoty. U jedu byla chromatografická recovery > 98 % a celkový obsah S odpovídal součtu S ve 27 detekovaných proteinech. Paralelní capLC-ESI-MS umožnila identifikaci proteinů a známost stechiometrie S–protein. Mezi hlavní komponenty patří 3FTx a PLA₂, doplněné SVMP a endonukleázou, v koncentracích až desítek µmol proteinu na gram jedu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje absolutní kvantifikaci intaktních proteinů bez nutnosti proteinově specifických standardů. Vhodná je pro komplexní biologické směsi, antijedové výzkumy, biobanka jedů a farmaceutickou kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na další heteroelementy (Fe, Se), aplikace v cílené proteomice, kombinace s high-resolution chromatografií, využití v QC biotechnologických produktů a potravinové bezpečnosti.

Závěr

capLC-ICP-QQQ s online IDA Sulfu je robustní a citlivá metoda pro absolutní kvantifikaci intaktních proteinů v komplexních matricích. Odstraňuje interferenční problémy díky MS/MS a nevyžaduje proteinově specifické standardy.

Reference

1. Warrell D.A., Lancet, 2010, 375, 77–88
2. Gutiérrez J.M. et al., Toxicon, 2010, 56(7), 1223–1235
3. Petras D. et al., J. Proteome Res., 2011, 10(3), 1266–1280
4. Méndez I. et al., Toxicon, 2011, 58(6–7), 558–564
5. Balcaen L. et al., J. Anal. At. Spectrom., 2013, 28, 33–39
6. De Raeve P., Bianga J., Agilent publikace 5991-6118EN, 2016
7. Wind M. et al., Angew. Chem. Int., 2003, 42, 3425–3427
8. Zhang H. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2004, 8(1), 66–75
9. Calderón-Celis F. et al., Anal. Chem., 2016, 88(19), 9699–9706
10. Agilent Technologies, Application Note 5991-9016EN, 2020