Using Heteroatoms as “Natural Labels” in the Quantitative Analysis of Active Pharmaceutical Ingredients by HPLC-ICP-MS

Význam tématu

Precizní stanovení aktivních farmaceutických látek je nezbytné jak ve fázi vývoje nových léčiv, tak v post-výrobní kvalitě. Tradiční LC-MS/MS nabízí vysokou selektivitu pro organické molekuly, ale citlivost různých API kolísá podle jejich struktury a vzorkové matice. HPLC-ICP-MS, a zejména trojkvadrupólový ICP-QQQ provozovaný v MS/MS režimu, umožňuje spolehlivé a elementárně založené kvantitativní měření heteroatomů (sír, fosfor, chlor), které fungují jako „přirozené značky“ v molekulách bez potřeby derivatizace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat aplikaci HPLC-ICP-QQQ v MS/MS režimu pro kvantitativní analýzu malých i velkých API obsahujících S, P nebo Cl a monoklonální protilátky (mAb). Studie zahrnovala:

• vývoj metod pro selektivní detekci heteroatomových iontů s využitím reakční buňky,
• optimalizaci HPLC separace pro různé třídy látek,
• určení detekčních limitů a test zpětného vymezení (recovery).

Použitá metodika a instrumentace

Separační sestava: Agilent 1260 Infinity Bio-inert HPLC s quaternárním čerpadlem a autosamplerem. Kolony: C18 pro malé molekuly a SEC-3 pro mAb. Mobilní fáze a gradienty byly přizpůsobeny typu API (organické rozpouštědlo či fosfátový pufr).
ICP-QQQ: Agilent 8800 s MS/MS režimem (reakční plyn O2 pro S a P, H2 pro Cl). Interní standardy Co a Y sledovaly stabilitu, kapalné fáze chráněny proti zanášení proudem O2/Ar. Reakční buňka selektivně posouvala ionty analyzovaných heteroatomů (např. 32S→32S16O), čímž se odstraňovaly polyatomické interferenční ionty.

Hlavní výsledky a diskuse

Stanovení tří sulfonamidových API (s obsahem S) vykázalo metody detekční limity 1,5 ppb S (23 nM API) a recovery okolo 100 %. Monoklonální protilátka (IgG2A) byla měřitelná při koncentracích od 14 nM (40 ng zásoběru), což odpovídá ~1 % obsahu S v proteinu. ZOMETA (zoledronová kyselina, P) dosáhla MDL 1,5 ppb P (25 nM API) a recovery 102 %. Catapres (klonidin, Cl) se stanovoval jako ClH2+ s MDL 15 ppb Cl (146 nM API) a 96 % recoverií. MS/MS režim ICP-QQQ poskytl jednotnou citlivost napříč matricemi bez významného potlačení signálu.

Přínosy a praktické využití metody

HPLC-ICP-QQQ umožňuje elementární kvantifikaci API s těmito výhodami:

• nezávislost odezvy na struktuře molekuly,
• minimální ovlivnění matricí díky reakční buňce,
• absenci potřeby derivatizace pro přirozeně obsahující heteroatomy sloučeniny,
• možnost víceprvkové analýzy v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj se zaměří na rozšíření aplikace na další heteroatomy a metal-tagging biomolekul pro cílené imunologické metody. Plánuje se optimalizace pro vysokofrekvenční screening, rozvoj online derivatizace a integrace s automatizovanými bioprocesními platformami pro QC v biotechnologiích.

Závěr

HPLC-ICP-QQQ v MS/MS režimu prokázalo vysokou citlivost, selektivitu a robustnost v kvantifikaci S, P a Cl v různých farmaceutických matricích. Díky elementárním přirozeným značkám nabízí tato technika perspektivu jako doplněk nebo alternativa ke klasickým LC-MS/MS přístupům v oblasti vývoje i kontroly kvality léčiv.

Reference

1. D. Esteban-Fernandez et al., J. Anal. At. Spectrom., 2007, 22, 1113.
2. A. K. Bytzek et al., Metallomics, 2011, 3, 1049.
3. D. Esteban-Fernandez, C. Scheler a M. W. Linscheid, Anal. Bioanal. Chem., 2011, 401, 657–666.
4. A. Prange a D. Pröfrock, J. Anal. At. Spectrom., 2008, 23, 432–459.
5. A. Sanz-Medel, Anal. Bioanal. Chem., 2008, 391, 885–894.
6. Q. He et al., J. Anal. At. Spectrom., 2014.
7. D. Iwahata et al., J. Anal. Sci. Methods Instrum., 2013, 3, 80–89.
8. V. I. Baranov et al., Anal. Chem., 2002, 74, 1629–1636.
9. N. Sugiyama a K. Nakano, Agilent Technical Note 5991-4585EN, 2014.
10. Wending D et al., The Journal of Rheumatology, 1993, 20(2), 259–262.