Rapid Digestion and Reproducible LC-MS Quantification of Cytochrome C: A Potential Biomarker for Apoptosis

Význam tématu

Cytochrom C je klíčový mitochondriální protein, který hraje zásadní roli v buněčném dýchání a řízené buněčné smrti (apoptóze). Jeho uvolňování do krevního oběhu je spojeno s poškozením mitochondrií a může sloužit jako biomarker řady patologických stavů. Rychlá, citlivá a reprodukovatelná kvantifikace cytochromu C v biologických matricích tedy znamená významný krok vpřed pro klinickou diagnostiku a farmakologický výzkum.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo vyvinout standardizovaný LC-MS workflow, který umožní:

• rychlou (10min) enzymatickou digesci cytochromu C v plazmě,
• efektivní čištění tryptických peptidů pomocí µElution SPE formátu,
• striktně reprodukovatelnou analýzu na UPLC-MS/MS s krátkou dobu běhu (5min),
• vysokou přesnost, precizi a citlivost kvantifikace v rozsahu 0,5–250 µg/mL.

Použitá instrumentace

• ProteinWorks eXpress Direct Digest Kit – rychlá enzymatická digesce,
• ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kit – post-digesční čistění peptidů,
• UPLC kolona CORTECS UPLC C18+, 1,6 µm, 2.1×50 mm,
• ACQUITY UPLC systém,
• Xevo TQ-S triple quadrupole hmotnostní spektrometr s ESI+,
• Software pro řízení MRM metod a zpracování dat.

Použitá metodika

• Příprava kalibračních standardů a QC vzorků: spiking bovinního cytochromu C do plazmy (0,5–250 µg/mL).
• Digesce 35 µL plazmy trvající 10 minut při optimálních podmínkách trypsinu.
• Čištění peptidů na µElution SPE destičkách bez nutnosti odpařování a rekonstituce.
• Separace peptidů na CORTECS UPLC C18+ koloni při 55 °C, 5min gradientu s mobilními fázemi 0,1 % HCOOH ve vodě a acetonitrilu.
• MRM monitoring čtyř vybraných tryptických peptidů (TGPNLHGLFGR, MIFAGIK, EDLIAYLK, GITWGEETLMEYLENPKK) s optimalizovanými přechody, energií kolize a napětím trysky.

Hlavní výsledky a diskuse

• Digesční a SPE kroky byly dokončeny za <40 minut pro 96 vzorků. Celková analýza LC-MS/MS trvala 8 hodin.
• Chromatografická separace na CORTECS UPLC zajistila baseline rozlišení isobarických přechodů, která BEH C18 300Å nedokázala dosáhnout.
• Recovery peptidů ≥90 % díky µElution SPE formátu, který minimalizuje ztráty.
• Lineární rozsah 2–250 µg/mL (R2>0,996) s LOQ 2 µg/mL (TGPNLHGLFGR) a 0,5 µg/mL pro zbývající peptidy; extrapolovaný LOD ~0,2 µg/mL.
• Relativní standardní odchylky (RSD) <5 % a přesnost 93–108 % napříč QC úrovněmi.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: kompletní vzorový workflow pod 1 hodinu, vysoká propustnost pro klinické a preklinické studie.
• Reprodukovatelnost: nízká variabilita zajišťuje spolehlivé sledování biomarkeru v rozsáhlých kohortách.
• Flexibilita: kit-based přístup umožňuje snadné zavedení do QA/QC laboratoří bez potřeby rozsáhlé metody developmentu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že LC-MS/MS kvantifikace proteinů se bude dále rozšiřovat díky multitargetovým přístupům a automatizaci vzorového zpracování. Integrace s mikrofluidickými platformami nebo imunoenrich­mentem může zvýšit citlivost pro nízkokoncentrované analyty. Kombinace s datově řízenými algoritmy pro analýzu proteomických sad rozšíří aplikace v personalizované medicíně.

Závěr

Prezentovaná metoda potvrzuje životaschopnost rychlé digesce a µElution SPE čistění pro přesnou a citlivou kvantifikaci cytochromu C v plazmě. Kit-based workflow zkracuje časovou náročnost, minimalizuje chyby a nabízí robustní platformu pro klinické i výzkumné nasazení.

Reference

1. Cytochrome C Structure. Wikipedia. 2015.
2. Alberts B. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 2002.
3. Radhakrishnan J. et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007.
4. UniProtKB P62894. 2007.