SENSITIVE AND REPRODUCIBLE LC-MS QUANTIFICATION OF C-REACTIVE PROTEIN IN PLASMA FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

C-reaktivní protein (CRP) je široce využívaný biomarker zánětu a rizika kardiovaskulárních i nádorových onemocnění. Tradiční imunochemické metody často postrádají dostatečnou specifičnost, multiplexní kapacitu a rychlost analýzy. Implementace kvantitativních LC-MS metod umožňuje dosáhnout vyšší selektivity, širokého lineárního rozsahu a krátké doby přípravy, což je klíčové pro farmaceutický výzkum i klinickou diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout citlivou, reprodukovatelnou a rychlou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci lidského CRP v plazmě s využitím komerčně dostupných souprav pro enzymatickou digesci a SPE čištění. Studie hodnotila:

• lineární dynamický rozsah a limity detekce (LLOQ, LOD),
• přesnost a opakovatelnost v ratí a lidské plazmě,
• minimální objem vzorku (35 µL) a zkrácený čas přípravy (< 3 h),
• komparabilitu kvantifikace pomocí tří signálních tryptických peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plazmy (35 µL) byl přímo digesován po dobu 2 h pomocí ProteinWorks eXpress Direct Digestion Kit (3-krokový protokol bez redukce/alkylace). Peptidy byly následně vyčištěny ProteinWorks µElution SPE Clean-Up Kit a kvantifikovány v LC-MS/MS módu MRM.

• Chromatografie: Waters ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 µm, 2,1×50 mm, gradient 0,1 % kyseliny mravenčí v vodě/ACN, průtok 0,3 mL/min.
• MS detekce: Waters Xevo TQ-XS triple quadrupole, ESI+, MRM přechody pro peptidy AFVFPK, ESDTSYVSLK a GYSIFSYATK.
• Kalibrace: standardní křivky v ratí i lidské plazmě, rozsah 0,025–100 µg/mL (4 dekády), vážení 1/x².
• Obnova: > 90 % pro všechny peptidy použitím mixed-mode SPE.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• lineární dynamický rozsah 0,025–100 µg/mL (R² > 0,997),
• LLOQ na úrovni 0,025 µg/mL (1–4 nM),
• přesnost 92–106 % a opakovatelnost RSD < 6 % v několika lucích ratí i lidské plazmy,
• konzistentní stanovení endogenního CRP v lidských plazmových vzorcích s rozdíly < 10 % mezi jednotlivými peptidy,
• krátký celkový čas přípravy vzorku < 3 hodiny.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaná metoda přináší významné výhody:

• multiplexní analýzu více biomarkerů ve stejném běhu,
• potřebu miniaturních objemů vzorku vhodných pro klinické studie,
• standardizaci a usnadnění validace díky komerčním kitům,
• rychlou implementaci v prostředí QA/QC laboratoří i farmaceutických výzkumných center.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• automatizované platformy pro vysokopropustné zpracování vzorků,
• rozšíření panelů na další zánětlivé a onkologické biomarkery,
• využití stabilně značených peptidových standardů pro absolutní kvantifikaci,
• aplikaci v rámcích personalizované medicíny a monitoringu léčby.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci CRP v plazmě splňuje požadavky na citlivost, přesnost, široký dynamický rozsah a rychlost zpracování. Je plně reprodukovatelná, vyhovuje klinickým a výzkumným aplikacím a představuje robustní alternativu k tradičním imunochemickým testům.

Reference

1. Kun E., Wu J., Karl J., Liao H., Zolg W., Guild B. Quantification of C-reactive protein in serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics 2004; 4(4):1175–1186.
2. Allin K.H., Nordestgaard B.G. Elevated C-reactive protein in the diagnosis, prognosis, and cause of cancer. Crit Rev Clin Lab Sci. 2011;48(4):155–170.
3. Waters Application Note (720005819EN). Sensitive and Reproducible LC-MS Quantification of C-Reactive Protein in Plasma: A Potential Biomarker of Inflammation.