Small Scale Peptide Isolation Using UPLC with Mass-Directed Purification

Význam tématu

Peptidové a další biologické molekuly se stávají klíčovými v oblasti terapeutik, diagnostiky a přesné medicíny. Efektivní izolace malých množství cílového peptidu při zachování vysoké čistoty je zásadní pro urychlení vývojových fází a minimalizaci spotřeby vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je demonstrovat použití systému ACQUITY UPLC H-Class společně s Waters Fraction Manager-Analytical (WFM-A) pro hmotnostně řízenou maloměřítkovou purifikaci syntetického peptidu. Proces zahrnuje screening hrubé směsi, optimalizaci gradientu a automatizované sbírání frakcí řízené detekcí hmotnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém ACQUITY UPLC H-Class se vzorkovačem, PDA detektorem, QDa detektorem a Isocratic Solvent Manager
• Waters Fraction Manager-Analytical (WFM-A) a software MassLynx s FractionLynx Application Manager
• Kolona ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm, 130 Å)
• Mobilní fáze A: 0,1 % TFA ve vodě; B: 0,1 % TFA v acetonitrilu; průtok 0,5 mL/min; teplota 30 °C
• Makeup solvent: 9:1 methanol:voda, 0,01 % kyselina mravenčí, průtok 0,6 mL/min
• MS detekce v ES+ módu, scan 100–1250 m/z, cone voltage 10 V, probe temp. 500 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Screening hrubé směsi odhalil cílový peptid a tři blízké impurity. Díky zúžení gradientu z 2,06 %/objem na 0,41 %/objem se významně zlepšilo rozlišení. Studie zatížení ukázala, že 16,2 µg vzorku poskytuje optimální poměr čistoty a výtěžku. Úprava gradientu na 28–31 % B v 3,4 min umožnila zkrácení doby analýzy při zachování separace. Překrývání 10 injekcí potvrdilo vynikající reprodukovatelnost chromatografie. Nízkodisperzní WFM-A zaručil sběr úzkých píků s vysokou přesností a minimalizací ztrát.
Hmotnostně řízená purifikace vedla k selektivnímu oddělení peptidu (m/z 595,3) a tří impurit, přičemž pooling frakcí z trojích injekcí usnadnil zpracování a zvýšil celkový výtěžek. Analýza pooled frakcí prokázala čistotu prvních dvou impurit a produktu nad 98 %, u třetí impurity byla snížena čistota kvůli koelucičnímu kontaminantu. Celkový výtěžek peptidu dosáhl 98,5 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení spotřeby vzorku a času díky maloměřítkovému přístupu
• Automatizovaný workflow s hmotnostní detekcí minimalizuje manuální zásahy
• Zvýšená selektivita a citlivost díky kombinaci UV a MS detekce
• Vysoká čistota a výtěžek vhodné pro preklinické experimenty

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k lepší integraci s vysokopropustným screeningem, adaptivnímu řízení metod pomocí strojového učení a rozšíření na další biologické makromolekuly. Optimalizace frakcionace a škálovatelnost k polopreparativním systémům otevře nové uplatnění v průmyslové výrobě.

Závěr

Systém ACQUITY UPLC H-Class s WFM-A pro maloměřítkovou, hmotnostně řízenou purifikaci peptidů nabízí rychlý, reprodukovatelný a efektivní proces separace. Díky nízké disperzi, přesnému řízení gradientu a automatizované frakční sběru se dosahuje vysoké čistoty a výtěžku s minimálním plýtváním vzorku.

Reference

1. Elsevier B. V. Precision Medicine: The New R+D Paradigm, January 2017.
2. Wright CL, Pan Q, Knopp MV, Tweedle MF. Advancing Theranostics with Tumor-Targeting Peptides for Precision Otolaryngology, World Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery (2016) 2, 98-108.
3. Jablonski J., Wheat T., Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Technical Note 720002955EN. February 2009.
4. Optimized System Dispersion for UPLC Performance in a Versatile LC Design. Waters Technology Brief 720003651EN. July 2010.
5. Exact Control of Solvent Composition with the ACQUITY UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager. Waters Technology Brief 720004405EN. July 2012.
6. Delivering Repeatable, Linear, and Accurate Injection Volumes for UPLC and HPLC. Waters Technology Brief 720003445EN. April 2010.