A GENERIC KIT-BASED APPROACH FOR LC-MS/MS QUANTIFICATION OF URINARY ALBUMIN FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

Albuminurie je klíčovým ukazatelem poškození ledvin a její přesné stanovení v moči je nezbytné pro včasnou diagnostiku a sledování renálních onemocnění. Tradiční imunochemické metody často trpí omezenou reprodukovatelností, standardizací a dynamickým rozsahem. LC-MS/MS nabízí řešení s vysokou selektivitou, citlivostí a schopností multiplexního stanovení.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané práce je vyvinout standardizovanou, kit-based LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci albuminu v moči v klinickém výzkumu. Metoda má poskytovat rychlé, citlivé a reprodukovatelné výsledky v rozsahu 0,1–500 µg/mL s minimálním objemem vzorku (15 µL) a celkovým časem přípravy menším než 4 hodiny.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorků byla použita ProteinWorks eXpress Digest Kit pro tryptickou digesci a ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit pro separaci a koncentrovaní peptidů. Po digesci následuje SPE očista a eluce peptidů, které jsou přímo injektovány na UPLC systém.

Použitá instrumentace

• UPLC: Waters ACQUITY UPLC s BEH C18 kolonkou (300Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm), mobilní fáze 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a acetonitrilu.
• MS/MS: Waters Xevo TQ-XS triple quadrupole MS (ESI+), sledování dvou MRM přechodů pro čtyři albuminové tryptické peptidy (YLYEIAR, FQNALLVR, LVNEVTEFAK, VFDEFKPLVEEPQNLIK).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární dynamický rozsah 0,1–500 µg/mL s hodnotami R2 > 0,997. Přesnost (accuracy) se pohybovala v rozmezí 85–107 % a relativní chyba (CV) byla méně než 8,1 % napříč třemi různými šaržemi moče. Čtyři primární peptidy vykázaly ostré chromatografické vrcholy (<4,5 s) a vysokou selektivitu vůči matrice.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: kompletní analýza včetně přípravy vzorku za méně než 4 hodiny.
• Senzitivita: dolní kvantifikační mez 0,1 µg/mL, blížící se imunotestům.
• Široký dynamický rozsah: měření jak nízkých, tak zvýšených hladin albuminu.
• Robustnost a standardizace: použití komerčních kitů s předem odměřenými reagenсemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření přístupu na další renální a kardiovaskulární biomarkery v multiplexních panelech, další zkrácení doby přípravy pomocí automatizace a zvýšení propustnosti analýzy. Integrace s klinickými informačními systémy a standardizace napříč laboratořemi posílí přenositelnost metody.

Závěr

Popsaná kit-based LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci albuminu v moči nabízí rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení s širokým dynamickým rozsahem. Díky standardizovaným protokolům a komerčně dostupným kitům je vhodná pro klinické výzkumné laboratoře i průmyslová QA/QC pracoviště.

Reference

• Wikipedia contributors. Human serum albumin. Wikipedia. Accessed 27 Feb 2017.
• Tesch GH. Serum and urine biomarkers of kidney disease: A pathophysiological perspective. Nephrology. 2010;15:609–616.
• Beasley-Green A, Burris NM, Bunk DM, Phinney KW. Multiplexed LC-MS/MS assay for urine albumin. Journal of Proteome Research. 2014;13:3930–3939.
• deJong PE, Gansevoort RT, Bakker SJ. Macroalbuminuria and microalbuminuria: Do both predict renal and cardiovascular events with similar strength? Nephrology. 2007;20:375–380.
• Polkinghorne KR. Detection and measurement of urinary protein. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 2006;15:625–630.
• Choi S, Choi EY, Kim HS, Oh SW. On-site quantification of human urine albumin by a fluorescence immunoassay. Clinical Chemistry. 2004;50:1052–1055.
• Seegmiller JC et al. Comparison of urine albumin quantification by immunoturbidimetry, competitive immunoassay, and protein-cleavage LC-MS/MS. Clinical Chemistry. 2009;55:1991–1994.
• Cell Biolabs Inc. Human Albumin ELISA Kit Product manual STA-383. San Diego, CA; 2017.
• UniProt consortium. UniProtKB – P02768 ALBU_Human. Accessed 27 Feb 2017.