ADAPTACE METODY RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 IN PLASMA AND SERUM – ON LINE ANALYSIS PRO VZORKY SUCHÉ KREVNÍ SKVRNY (DBS)

Význam tématu

Vitamin D ve formách 25(OH)D2 a 25(OH)D3 je klíčový pro regulaci vápníkové homeostázy, imunitní funkce a prevenci mnoha chronických onemocnění. Tradiční stanovení ve venózní krvi vyžaduje náročný odběr a skladování. Metoda využívající suché krevní skvrny (DBS) nabízí méně invazivní alternativu vhodnou pro vzdálený odběr a snazší logistiku ve velkých studiích i rutinní diagnostice.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo adaptovat komerčně dostupnou metodu RECIPE pro stanovení 25-OH-vitaminů D2/D3 z plazmy či séra na formát DBS. Hlavním záměrem bylo vyvinout robustní, reprodukovatelnou a klinicky použitelnou techniku odběru kapilární krve, která umožní sledování vitaminu D v populaci méně náročnou cestou.

Použitá metodika

Preanalytická fáze:

• Odběr kapilární krve pomocí systému Capitainer B (Quantitative DBS system).
• Nanesení kapky na kazetu a koncentrace na analytický disk.

Extrakce a příprava vzorku:

• Extrahent RECIPE Precipitant P/IS (d6-25-OH-D3) v objemu 400 µl, vortex 6 h při pokojové teplotě.
• Centrifugace 15 000 rpm po dobu 5 minut.
• Odběr supernatantu 50 µl přímo do autosampléru.

Analytika:

• UHPLC/HRMS v režimu full scan.
• Kolona LUNA® Omega Polar C18 (50 × 2,1 mm, 1,6 µm).

Použitá instrumentace

• UHPLC Ultima 3000 (Thermo Fisher Scientific).
• Detektor Q Exactive Focus (Thermo Fisher Scientific) optimalizovaný pro ionty 395,325 m/z (D2) a 383,331 m/z (D3).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda DBS pro 25-OH-D3 prokázala lineární kalibraci (r2 > 0,99) v rozsahu 0–90 ng/ml. U první skupiny 8 dobrovolníků bylo D3 detekováno v rozmezí 22,56–93,56 nmol/l, D2 nebylo naměřeno. Optimalizace doby vortexování na 6 h zlepšila výtěžnost extrakce. Porovnání se sérovými vzorky ukázalo korelaci hodnot, přičemž konvergenční faktor nebyl nutný. Rozdíly mezi různými DBS nosiči (Capitainer vs. Whatman) ovlivňují čas přípravy a rozměry disku.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimálně invazivní odběr vhodný pro pediatrická a polní měření.
• Jednodušší skladování a transport vzorků při room temperature.
• Možnost velkosériového screeningu populace na nedostatek vitaminu D.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je validační fáze na rozsáhlejším souboru vzorků, standardizace DBS kalibrací a stanovení konvergenčního faktoru pro různé hematokritové hodnoty. Integrace metody do telemedicínských platforem, automatizace přípravy DBS a rozšíření na další metabolity steroidů otevírá prostor pro personalizovanou medicínu a nutriční screening.

Závěr

Adaptovaná metoda DBS na bázi komerční sady RECIPE pro stanovení 25-OH-D2/D3 poskytuje spolehlivý, lineární a reprodukovatelný přístup k monitorování vitaminu D. Menší náročnost odběru a logistika DBS umožňují širší aplikaci v klinickém i výzkumném prostředí.

Reference

V textu nebyly uvedeny samostatné literární odkazy.