VITATOX: Adaptace metody RECIPE® 25-OH-VITAMIN D2/D3 in plasma and serum – on-line analysis pro vzorky suché krevní skvrny (DBS)

Význam tématu

Měření 25-hydroxyvitaminu D ve formě suchých krevních skvrn (DBS) představuje méně invazivní, jednoduše distribuovatelnou a nákladově efektivní alternativu k odběru séra či plazmy. Tento přístup umožňuje masové populační screeningy, sledování nutričního stavu a dlouhodobé ukládání vzorků bez nutnosti chladového řetězce. Úspěšné převedení komerčně ověřené metody RECIPE® na DBS formát otevírá cestu ke zlepšené péči o pacienta a zjednodušení klinických studií i rutinních laboratorních analýz.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo adaptovat platformu RECIPE® pro kvantitativní stanovení 25-OH-vitaminu D2 a D3 v plazmě a séru na režim analýzy DBS. Hlavními záměry byly:

• Vyvinout robustní a reprodukovatelnou extrakční proceduru z DBS.
• Optimalizovat podmínky přípravy vzorku (doba vortexování, objem precipitantu).
• Srovnat výsledky stanovení ve vzorcích DBS s výsledky v séru a plazmě.
• Ověřit linearitu, přesnost a opakovatelnost metody pro následnou rutinní aplikaci.

Použitá instrumentace

• Kapilární odběr: Quantitative DBS system Capitainer B (Capitainer, Švédsko) a filtrační papíry Whatman pro screening novorozenců.
• UHPLC/HRMS: Q Exactive Focus (Thermo Fisher Scientific) v full scan režimu.
• UHPLC systém: Dionex Ultima 3000 s kolonnou LUNA Omega Polar C18 (1,6 µm, 50 × 2,1 mm).
• Interferenční látky a interní standardy: RECIPE® Precipitant P/IS s deuterovaným d6-25-OH-D3.
• Kalibrátory: ClinCal®-Calibrator RECIPE; kontrolní vzorky ClinChek®-Control (Levels I a II).

Použitá metodika

Po zaschnutí kapky kapilární krve na DBS disku následuje extrakce v roztoku precipitantu P/IS. Vortexování probíhá standardně 6 hodin (u Capitainer B) nebo 2–3 hodiny (u tenčích Whatman disků), následná centrifugace (15 000 rpm, 5 min), inkubace při 4 °C a opětovná centrifugace. Získaný supernatant (50 µl) je přímo aplikován na UHPLC/HRMS systém. Metoda byla optimalizována pro poměr materiál/roztok a čas extrakce. Analytická kalibrace vykázala v obou kanálech (D2, D3) výbornou linearitu s R2 > 0,995.

Hlavní výsledky a diskuse

• Skupina 1 (8 dobrovolníků): 25-OH-D3 v DBS 22,6–93,6 nmol/l, 25-OH-D2 pod detekčním limitem.
• Optimalizace extrakce potvrdila, že u vysokých hladin D3 (62,6 nmol/l) je metoda reprodukovatelná.
• Skupina 2 (7 dobrovolníků): porovnání DBS vs. sérum ukázalo pro D2 rozsah 19,6–20,6 nmol/l v DBS, pro D3 rozsah 48,7–109,3 nmol/l v DBS. Korelační parametry přiblížily metodu DBS k referenčnímu sérovému stanovení (R2 > 0,99).
• Evropská populace často vykazuje hladiny < 50 nmol/l, což poukazuje na potřebu dostupných screeningových metod.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem vzorku a neinvazivní odběr zvyšují komfort pacienta a usnadňují distanční odběry.
• Metoda je vhodná pro rozsáhlé populační studie, pediatrické aplikace a screening novorozenců.
• Mohou být sledovány sezónní a geografické rozdíly ve stavu vitaminu D bez nutnosti chlazení vzorků.
• Validovaný lineární kalibrační přístup eliminuje potřebu konvergenčního faktoru při přechodu mezi matrixemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace odběru a přípravy DBS vzorků pro vysokoprůtokové laboratoře.
• Integrace telemedicíny a domácích odběrů krve pro monitorování chronických onemocnění.
• Rozšíření na další biomarkery (steroidní metabolity, aminokyseliny) v režimu multi-analyzátoru.
• Implementace v potravinářských a farmaceutických studiích fortifikace vitaminem D.

Závěr

Metoda adaptovaná na DBS formát pro stanovení 25-OH-D2/D3 prokázala vysokou citlivost, linearitu i reprodukovatelnost. Optimalizace extrakčního postupu a srovnání s referenčním sérem potvrdily vhodnost pro rutinní monitorování stavu vitaminu D. Rozdíly mezi typy disků (Capitainer vs. Whatman) poukazují na nutnost přizpůsobení extrakčních parametrů. Výsledná metoda významně rozšiřuje možnosti jednoduchého a spolehlivého screeningu stavů vitamínu D v široké populaci.

Reference

1. Lacey JM. Clin. Chem. 2004;50(3):621.
2. Wong T. Clin. Chem. 1992;38:1830.
3. Donohue PA. The metabolic and molecular bases of inherited disease. 8th ed. Vol. 3. New York: McGraw-Hill; 2001. p. 4077.
4. Wiesinger T, Mechtler TP, Schwarz M, Engl J, Kaspar DC. Steroid Profiling in Dried Blood Spots by using the RECIPE LC-MS/MS. ARCHIMEDlife/RECIPE Poster.
5. Yetley EA, Pfeiffer CM, Schleicher RL, Phinney KW, Lacher DA, Christakos S, et al. NHANES. 2010;140(11):2030S–2045S.
6. RECIPE GmbH. MS7000, MS7100, MS7200, 25-OH-Vitamin D2/D3 in Plasma and Serum. ClinMass LC-MS/MS Complete Kit; Instruction Manual IVDD 98/79/EC.
7. Mathew EM, Moorkoth S, Rane PD, Lewis L, Rao P. Chem. Pharm. Bull. 2019;67(2):88–95.
8. Heath AK, Williamson EJ, Ebelig PR, Kvaskoff D, Eyles DW, English DR. J Clin Endocrinol Metab. 2014;99(9):3319–3329.
9. Gupta R, Behera C, Paudwal G, et al. AAPS PharmSciTech. 2019;20(11):11.
10. Hoeller U, Baur M, Roos FF, et al. Br J Nutr. 2016;115(2):202–211.