13C Qualitative Flux Analysis with Symphony Software and Polly Software of Non-Small Cell Lung Carcinoma Cells Grown in vitro in Two and Three Dimensions

Význam tématu

Studium metabolických toků pomocí značeného glukózového substrátu je klíčové pro pochopení buněčné energetiky a adaptace nádorových buněk. Porovnání 2D monovrstev s 3D sféroidy přináší hlubší vhled do rozdílů mikroprostředí in vitro a lépe napodobuje podmínky in vivo. Tyto znalosti mohou ovlivnit vývoj protinádorových terapií a interpretaci výsledků biochemických experimentů.

Cíle a přehled studie / článku

Analýza relativních toků 13C-glukózy ve dvou a třech dimenzích kultivovaných buněk nemalobuněčného karcinomu plic (linie H1299). Studie demonstruje použití softwaru Symphony ve spojení s PollyPhi pro automatizované zpracování dat z LC–MS a následnou vizualizaci distribuce izotopů v klíčových metabolických drahách.

Použitá metodika a instrumentace

• Cell kultura: H1299 pěstované jako monovrstva v DMEM a jako 3D sféroidy na površích potažených pHEMA
• Značení: inkubace s [U-13C] glukózou
• Extrahování metabolitů: lyze teplotním šokem, extrakce MeOH/CHCl3, srážení a sušení vzorků
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class, kolona BEH C18 1,7 μm 2,1×50 mm, gradientní eluce s 0,1% kyselinou ve vodě a acetonitrilu
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo G2-XS QTof, ESI-, MS E, rozlišení 30000 FWHM, rozsah 50–1200 m/z
• Informatika: MassLynx pro akvizici, Symphony pipeline spouštějící MSConvert (mzXML), ElMaven pro detekci a integraci, PollyPhi pro korekci přirozené abundance a vizualizaci

Hlavní výsledky a diskuse

• Sféroidy vykazují výrazně vyšší obohacení laktátu izotopem 13C3 než monovrstvy, což indikuje zvýšenou glykolýzu
• Intermediáty TCA cyklu nesou vyšší podíl 13C2 izotopologu ve sféroidech, což svědčí o intenzivnějším přenosu uhlíku z glukózy přes pyruvát a acetyl-CoA
• Rozdíly v nutrientním využití mezi 2D a 3D kulturami mohou zásadně ovlivnit přenos experimentálních poznatků do in vivo modelů

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný LC-MS-based workflow zrychluje zpracování velkých datasetů a snižuje variabilitu ručních kroků. Kombinace Symphony a PollyPhi umožňuje rychlou detekci metabolitů, korekci izotopové abundance a intuitivní mapování toků na metabolické dráhy. Metoda je vhodná pro farmakologický výzkum, QA/QC studií a základní i preklinický výzkum onkologie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dat z proteomiky a lipidomiky pro komplexní systémovou analýzu
• Použití mikrofluidických 3D kultivací pro vysokopropustné screeningy
• Využití strojového učení pro predikci metabolických adaptací
• Rozšíření o imaging hmotnostní spektrometrii pro prostorové mapování metabolitů

Závěr

Kultivační geometrie výrazně modifikuje metabolické toky, což má zásadní dopad na interpretaci in vitro studií. Automatizované řešení založené na Symphony a PollyPhi poskytuje robustní platformu pro analýzu izotopového značení a podporuje přenos výzkumných zjištění do in vivo modelů a klinické praxe.

Reference

1. Li a kol. Survival advantages of multicellular spheroids vs monolayers of HepG2 cells in vitro. Oncol Rep. 2008 Dec;20(6):1465–71
2. Wallace a kol. A Model for Spheroid versus Monolayer Response of SK-N-SH Neuroblastoma Cells to Treatment with 15-Deoxy-PGJ2. Comput Math Methods Med. 2016;2016:3628124
3. Fernandez a kol. The mitochondrial citrate carrier, SLC25A1, drives stemness and therapy resistance in non-small cell lung cancer. Cell Death Differ. 2018 Jul;25(7):1239–1258
4. Waters Corporation. Automating Metabolic Flux Analysis with Symphony and Polly. Technical Brief 720006380EN. 2018