13C Glucose Qualitative Flux Analysis in HepG2 cells

Význam tématu

Metabolická flux analýza založená na stopových značených izotopech poskytuje hluboký vhled do dynamiky buněčného metabolismu, který nelze odhalit pouhým stanovením koncentrací metabolitů. Díky měření poměrů izotopologů je možné sledovat tok uhlíku skrz klíčové biochemické dráhy, například trikarboxylový cyklus (TCA) či anaplerotické cesty. Tento přístup je zvláště významný v onkologii, biotechnologii a farmakologii, kde změny v energetickém a biosyntetickém profilu buněk ovlivňují jejich fenotyp a citlivost na léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikované studie bylo demonstrovat kvalitativní flux analýzu v lidských karcinomových buňkách HepG2 s využitím U-13C značené glukózy a porovnat metabolický dopad potlačení enzymu pyruvát-karboxylázy (PC). Buňky s různou úrovní knockdownu PC byly kultivovány s 13C-glukózou, následně extrahovány a analyzovány na platformě Agilent 6546 LC/Q-TOF s následným zpracováním v softwarovém balíku VistaFlux. Studie ilustruje, jak snížení aktivity PC mění tok uhlíku v TCA cyklu a anaplerotické využití glutamátu.

Použitá instrumentace

• LC/MS systém: Agilent 1290 Infinity II LC spojený s 6546 Q-TOF (Jet Stream ESI, negativní ionizace).
• Kolona: InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1 × 100 mm, 2,7 µm) s HILIC-Z Guard kolonkou (2,1 × 5 mm, 2,7 µm).
• Mobilní fáze: 10 mM ammonium acetát pH 9,0 s deaktivačním aditivem ve vodě (A) a vodě/ACN 10:90 (B), tok 0,25 mL/min, gradient 90→60→90 %B.
• Teploty: kolona 25 °C, autosampler 6 °C, zdrojová teplota 200 °C, sheath gas 300 °C.
• Softwarové nástroje: MassHunter Acquisition 10.0, Profinder V10.0, Pathways to PCDL, PCDL Manager, Omix Premium V1.9.30, VistaFlux workflow.

Použitá metodika

1. Příprava knockdown buněk HepG2 pomocí siRNA pro pyruvát-karboxylázu.
2. Kultivace v DMEM s 3 mM nenesoucí glukózou, následná inkubace 30 min s 10 mM U-13C glukózou.
3. Extrahování metabolitů 8:1:1 (v/v/v) methanol:chloroform:voda, sonikace a centrifugace.
4. Chromatografická separace HILIC-Z kolonkou a analýza Q-TOF MS v m/z 50–1 000.
5. Datová analýza: sestavení vlastního PCDL s klíčovými metabolity, hromadná extrakce izotopologů v Profinderu s korekcí přirozeného výskytu, vizualizace výsledků v Omix Premium.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza isotopologů malátu, citrátu a glutamátu odhalila:

• Vysoké rozlišení (>40 000) a koeficient variability (CV < 5 %) umožnily spolehlivé stanovení nízkých úrovní značení.
• U kontrolních HepG2 buněk dominovalo m+2 značení citrátu (~50 % obohacení), u PC-knockdown buněk bylo ~25 %.
• Glutamát m+0 se akumuloval ve knockdown buňkách, zatímco v kontrolách byl spotřebováván – potvrzení kompenzační anaplerózy glutamátu při omezeném příjmu 13C uhlíku.
• Vizualizace v Omix Premium ukázala rozdíly v individuálních izotopologech (m+2 až m+5), korespondující s omezenou rychlostí otoček TCA cyklu u knockdown buněk.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow kombinující Agilent 6546 LC/Q-TOF a VistaFlux přináší:

• Rychlou a vysoce selektivní kvalifikaci izotopologů v komplexních vzorcích.
• Možnost sledovat dopad genetických modifikací nebo farmak na buněčný metabolismus.
• Uplatnění v biomedicínském výzkumu rakoviny, vývoji léčiv a biotechnologické optimalizaci produkčních kmenů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace kvantitativní flux analýzy a dynamických kinetických modelů.
• Rozšíření spektra tracerů (15N, 2H) a kombinovaná multiomics data (proteomika, transkriptomika).
• Automatizace datové analýzy pomocí strojového učení pro rychlejší identifikaci klíčových metabolických změn.
• Miniaturizace a zvýšení propustnosti díky pokročilým mikrofluidickým HILIC modulům.

Závěr

Platforma Agilent 6546 LC/Q-TOF v kombinaci se softwarovým balíčkem VistaFlux představuje výkonný nástroj pro kvalitativní metabolickou flux analýzu. Umožňuje detailní sledování 13C značení v TCA cyklu a identifikaci kompenzačních cest anaplerózy. Tento přístup přispívá k lepšímu pochopení buněčné energetiky a biosyntézy, zejména v kontextu onkologických a metabolických onemocnění.

Reference

1. Phannasil P.; et al. Mass spectrometry analysis shows the biosynthetic pathways supported by pyruvate carboxylase in highly invasive breast cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta, 2017, 1863(2), 537–551.
2. Hsiao J. J.; et al. Monitoring of Mammalian Cell Culture Media with HILIC LC/MS. Agilent Technologies Application Note 5994-0024EN, 2018.