Impact of Instrument and Detector Characteristics on Size Exclusion Chromatography Method Transfer Across Biocompatible UHPLC Systems

Význam tématu

Analýza velikostních variant monoklonálních protilátek metodou SEC za nativních podmínek je klíčová pro hodnocení jejich bezpečnosti a účinnosti. Agregáty (HMW) mohou vyvolat nepříznivé imunitní reakce a snížit terapeutický efekt, zatímco degradáty s nižší molekulovou hmotností (LMW) vznikají štěpením peptidové vazby. Robustní, přenositelná a citlivá metoda SEC je proto v biopharmaceutickém vývoji nezbytná.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat přenos SEC metody pro trastuzumab mezi biokompatibilními UHPLC systémy ACQUITY Arc Bio a Agilent 1260 Infinity Bio-inert. Dále se studie zaměřila na srovnání dvou typů UV detektorů (PDA vs. tunable UV) z hlediska opakovatelnosti dat a citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Obě měřicí sestavy byly vybaveny kolonnou XBridge Protein BEH SEC (200 Å, 3,5 µm, 7,8 × 300 mm) a pracovaly s mobilní fází 25 mM fosfátu sodného, 400 mM chloridu sodného, pH 6,7 při průtoku 0,7 mL/min a 40 min běhu. Teplota vzorku 4 °C, objem injekce 10 µL. Detektory: Waters 2998 PDA, Waters 2489 TUV a Agilent 1260 DAD VL+. Data sbíráno v Empower 3 CDS a OpenLab CDS Chemstation, konvertováno do Empower.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla úspěšně přenesena mezi oběma systémy s rozdílem retence jednotlivých piků do 0,14 min a opakovatelností retence (%RSD) < 0,2 %. Kvantitativně bylo rozdílné zastoupení HMW a monomeru pouze o 0,02 % plochy, s %RSD < 3 %. Vyšší variabilita u LMW (až ~12 % na Agilent) souvisí s nízkým procentuálním obsahem. System ACQUITY Arc Bio vykázal mírně lepší opakovatelnost než Agilent 1260. Porovnání detektorů ukázalo, že TUV detektor přináší až dvojnásobné zvýšení poměru signál/šum (HMW 205 vs. 105, LMW 50 vs. 24) a lepší %RSD u degradantů.

Přínosy a praktické využití metody

• Dokázaná přenositelnost metody mezi různými biokompatibilními UHPLC systémy
• Spolehlivá kvantifikace agregátů i nižších degradantů
• Optimalizace volby detektoru pro zvýšení citlivosti a opakovatelnosti

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj biokompatibilních materiálů pro LC systémy (MP35N, titan, PEEK)
• Integrace alternativních detekčních přístupů (fluorescenční, MS) pro vyšší selektivitu
• Automatizace přenosu metody a využití strojového učení pro rychlejší validaci

Závěr

Metoda SEC pro trastuzumab je plně přenositelná mezi testovanými biokompatibilními systémy a poskytuje konzistentní a opakovatelná data. Volba tunable UV detektoru přináší významné zlepšení citlivosti a opakovatelnosti, což podporuje její aplikaci v rutinní QC i vývojových laboratořích.

Reference

1. Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The AAPS Journal. 2006;8:501–7.
2. Xiang T., Lundell E., Sun Z., Liu H. Structural effect of a recombinant monoclonal antibody on hinge region peptide bond hydrolysis. Journal of Chromatography B. 2007;858:254–62.
3. Koza S., Hong P., Fountain KJ. Size-Exclusion Ultra Performance Liquid Chromatography Method Development for the Analysis of the Degradation Products of the Trastuzumab Antibody. Application Note; 2012;720004416EN.
4. Waters 2489 UV/Visible Detector Operator’s Guide.
5. Waters 2998 Photodiode Array Detector Operator’s Guide.