Impact of Instrument Characteristics on Reversed Phase Chromatography Method Transfer Across Biocompatible UHPLC Systems

Význam tématu

Reverzní fázová chromatografie je klíčová pro charakterizaci proteinových biomolekul v biotechnologickém průmyslu. Metoda přenosu analytických postupů mezi různými biokompatibilními UHPLC systémy pomáhá minimalizovat opakovaný vývoj metod a ztráty produktivity. Umožňuje rychlejší nasazení validovaných protokolů v rámci vývoje i rutinní kontroly kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat bezproblémový přenos RP metody pro separaci subjednotek monoklonální protilátky (mAb) mezi ACQUITY Arc Bio System a Agilent 1260 Infinity Bio-inert System. Autoři porovnali retenční časy, šířky píků a plochy píků, aby ověřili konzistenci výsledků mezi systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: IdeS‐digestion NIST mAb rozštěpená na tři subjednotky (2× Fc/2, 2× Fd′, 2× light chain), koncentrace 0,25 mg/mL.
Chromatografické podmínky:

• Kolona BioResolve RP mAb Polyphenyl, 450 Å, 2,7 μm, 4,6 × 50 mm, teplota 65 °C
• Mobilní fáze A: 0,1 % TFA ve vodě; B: 0,1 % TFA v acetonitrilu; gradient 85→20 % A v 20,3 min, návrat na 85 % A do 21,6 min; průtok 0,96 mL/min
• Detekce UV při 280 nm, snímkování 10 Hz

Instrumentace:

• ACQUITY Arc Bio System (QSM-R Bio pumpy, FTN-R Bio injektor, 2998 PDA detektor)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert System (1260 Bio Quat pumpa, HiP Bio ALS injektor, 1260 DAD VL+ detektor)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání chromatogramů ukázalo téměř identické profily ve dvou systémech. Extra-column objem byl 19 μL (ACQUITY) vs. 24 μL (Agilent), což se odrazilo v podobné šířce píků (W50 % ~0,05 min). Rozdíl průměrných retenčních časů subjednotek byl ca. 0,06–0,08 min (<1 % RT) s %RSD <0,2 %. Kvantifikace ploch píků vykázala rozdíly <1 % a %RSD <1 % pro všechny tři subjednotky.
Pomocí Multi-flow path technologie ACQUITY Arc Bio lze volit cestu s různým dead volume. Rozdíl 0,31 mL mezi cestami způsobil posun retenčních časů o 0,32 min. Funkce Gradient SmartStart pak umožnila „posunout“ start gradientu o tuto hodnotu a dosáhnout původních RT bez úprav gradientového protokolu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a validovatelný přenos RP metody mezi různými biokompatibilními UHPLC systémy
• Minimální zásahy do existujících gradientových tabulek díky Multi-flow path a Gradient SmartStart
• Zajištění konzistentní kvality separací mAb subjednotek v rámci vývoje i rutinního provozu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metodiky směřuje k plné automatizaci přenosu metod napříč výrobci, včetně inteligentního vyhodnocení dead volume a automatické korekce gradientu. Integrace s MS detekcí a on-line charakterizací proteinů rozšíří možnosti detailní analýzy strukturálních variant.

Závěr

Studie prokázala úspěšný přenos RP metody pro mAb subjednotky mezi dvěma bio-inertními UHPLC systémy bez nutnosti měnit gradientové tabulky. Klíčovou roli sehrály nízké rozdíly v extra-column objemu a dead volume, stejně jako Multi-flow path technologie a Gradient SmartStart na ACQUITY Arc Bio System.

Reference

• Zhang X. et al. High-Throughput Analysis of Antibody Subunits Using a BioResolve RP mAb Polyphenyl Column. Waters Application Note 720006204EN, 2018.
• Waters. Care and Use Manual: mAb Subunit Standard, 186008927, 2018.
• Hong P., McConville P. Dwell Volume and Extra-Column Volume: What Are They and How Do They Impact Method Transfer. Waters Application Note 720005723EN, 2016.
• United States Pharmacopeia. Chapter <621> Chromatography. USP 37–NF 32 S2, 2014.