Evaluating HPLC, UHPLC, and UPLC System Performance Using a Reversed-Phase Method for Peptides

Význam tématu

Vývoj a validace chromatografických metod pro analýzu peptidů je klíčový v oblasti biofarmacie a QC. Nižší disperze systémů kapalinové chromatografie umožňuje přesnější rozlišení složitých biomolekul a zvyšuje kapacitu analýzy, což podporuje kvalitu a účinnost analytických procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkon tří platforem (HPLC, UHPLC, UPLC) z hlediska šířky pásma, rozlišení a kapacity peaku pomocí konzervované reverzní fázové metody pro peptidy. Autoři využili standardní směs peptidů a měřili extra column band broadening a chromatografické parametry pod identickými podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza zahrnovala dvě experimentální části:

• Měření extra column band broadening pomocí isokratické eluční metody (30:70 voda:acetonitril) s injekcí 1 µL kofeinu a nulovým mrtvým objemem.
• Reverzní fázová gradientová separace peptidů (10min gradient 5–50 % acetonitrilu v 0,1 % TFA) na kolonce Waters XBridge BEH C18 (4,6×100 mm, 2,5 µm, 130 Å).

Použitá instrumentace

• HPLC: Alliance s UV/Vis detektorem
• UHPLC: ACQUITY Arc Bio System s UV/Vis detektorem
• UPLC: ACQUITY H-Class Bio System s TUV detektorem

Hlavní výsledky a diskuse

Nižší disperze systémů přinesla výrazné zúžení šířky píků a zvýšení rozlišení:

• Extra column band broadening: HPLC ~50 µL, UHPLC ~23 µL, UPLC ~7 µL.
• Rozlišení mezi kritickými peaky: HPLC 1,7; UHPLC 2,7; UPLC 3,1.
• Peak capacity (4σ): HPLC 118; UHPLC 170; UPLC 196.

Výsledky ukazují, že fyzikální vlastnosti průtokové cesty významně ovlivňují výkon chromatografického systému a modernizace přináší praktické zlepšení v analýze peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Nižší disperzní systémy umožňují:

• Vyšší citlivost a přesnost rozlišení složitých směsí peptidů.
• Aktualizaci stávajících metod bez změny kolonek a gradientu.
• Rozšíření analytických možností v proteomice, QC a vývoji bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj směrem k vyšším pracovním tlakům a menším částicím, miniaturizaci kolonek, automatizaci workflow a integraci s vysoce výkonnými detektory a hmotnostní spektrometrií.

Závěr

Porovnání HPLC, UHPLC a UPLC potvrdilo význam snižování systémové disperze pro zlepšení kvality a efektivity chromatografické separace peptidů. Modernizace instrumentace nabízí významné výhody pro analýzu biomedicínských vzorků.

Reference

Waters Corporation. Evaluating HPLC, UHPLC, and UPLC System Performance Using a Reversed-Phase Method for Peptides. Technology Brief, May 2018. 720006275EN.