Dwell Volume and Extra-Column Volume: What Are They and How Do They Impact Method Transfer?

Význam tématu

Chromatografické separace jsou ovlivněny charakteristikami LC systému, zejména objemem předkolonového prostoje (dwell volume) a rozptylem mimo kolonu (extra-column volume). Tyto parametry významně ovlivňují retenci, šířku píků, rozlišení a účinnost metody a často se projeví až při přenosu nebo škálování metody na jiný systém. Jejich pochopení a kompenzace jsou klíčové pro spolehlivou metodu transfer a validaci v regulačním prostředí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku bylo charakterizovat a porovnat dwell volume a extra-column dispersion u různých LC platforem (HPLC, UHPLC, UPLC) a demonstrovat jejich dopad na přenos gradientních i izokratických metod. Studie rovněž předkládá strategie zmírnění těchto vlivů s využitím softwarových nástrojů podle USP <621> a volbou vhodné hardware konfigurace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro měření dwell volume byl aplikován gradient 0–100 % fáze B obsahující UV absorbující kofein. Čas, ve kterém detekce dosáhla 50 % absorbance, minus polovina programovaného gradientu, vynásobená průtokem, určovala objem prodlevy.
Pro vyhodnocení extra-column dispersion bylo použito nulové dead-volume spojení místo kolony, vzorek kofeinu (0,16 mg/mL) a měření šířky píku při 4σ (13,4 %) a 5σ (4,4 %) s UV detektorem (sampling rate 40 Hz).
Testované systémy a detektory:

• Waters Alliance HPLC (kvaternární pumpa, detektor PDA 2998)
• ACQUITY Arc (kvaternární pumpa, PDA detektor)
• ACQUITY UPLC H-Class PLUS (kvaternární pumpa, ACQUITY PDA)
• ACQUITY UPLC I-Class PLUS (binární pumpa, PDA detektor, SM-FTN dávkovač)

Kolony: CORTECS C18+ (1,6 µm, 2,1×50 mm) a CORTECS C18 (2,7 µm, 3,0×75 mm; 4,6×75 mm). Standardní a mikroobjemové flow buňky, běžné potrubí, mixery a přídavné ventily dle továrního nastavení.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dwell volume se pohybuje od ~0,07 mL (binary UPLC) do >1,15 mL (kvaternární HPLC). Kvaternární pumpy s gradient proportioning ventilem vykazují vyšší prodlevy než binární konfigurace.
• Rozdíl v dwell volume o ~0,775 mL způsobí posun retenčních časů až o 1,5 min v gradientních metodách. Kompenzace pomocí softwarového posunu startu gradientu minimalizuje nutnost měnit samotnou tabulku gradientu.
• Extra-column dispersion dosahuje 5σ mezi 43–45 µL u HPLC a poklesá až na ~7 µL u UPLC systémů. Největší vliv mají sloupcová pec, typ potrubí a detektorové flow buňky.
• U izokratických separací na 2,1 mm I.D. sloupci s pod-2 µm částicemi klesla účinnost na HPLC/UHPLC až o 50 % oproti UPLC kvůli poměru objemu kolony k mimo-kolonnímu rozptylu. U 4,6 mm I.D. sloupců je tento efekt výrazně menší.
• U gradientních separací výměna standardní (10 µL) za mikroobjemovou (2,7 µL) flow buňku zvýšila rozlišení až o 50 % bez ztráty citlivosti díky zúžení šířky píků.

Přínosy a praktické využití metody

Charakterizace systémových objemů umožňuje prediktivní přenos metod mezi různými LC platformami. Softwarová úprava startu gradientu zkracuje dobu vývoje a omezuje nutnost revalidace. Volbou nízkoodporných tubusů a mikroflow buňky lze zlepšit rozlišení a citlivost bez výrazných hardwarových zásahů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k integraci automatických nástrojů pro měření a kompenzaci dwell a extra-column objemů přímo v instrumentálním softwaru. Miniaturizace komponent, optimalizace potrubí a adaptivní metody škálování podpoří rychlejší a přesnější transfer analytických postupů napříč komerčními i výzkumnými laboratořemi.

Závěr

Úspěch metody transfer závisí na podrobném posouzení dwell volume a extra-column dispersion. Jejich optimalizace prostřednictvím softwarových korekcí a volby vhodných komponent výrazně zvyšuje robustnost gradientních i izokratických separací bez nutnosti rozsáhlých úprav původního gradientu.

Reference

1. USP <621> Chromatography, USP 37-NF 32 S1, 2014, s. 6376–85
2. Dolan JW. Dwell Volume Revisited. LCGC North America. 24.
3. Waters Corp. Protocol for Gradient Delay Measurement. App Notebook, 2013, s. 67–68
4. USP <621> Chromatography, USP 37-NF 32 S2, 2014, s. 6376–85
5. Wu N, Bradley AC. J Chromatogr A. 2012;1261:113–20
6. Striegel AM et al. Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. Wiley, 2009, s. 49–91
7. Gritti F, Guiochon G. J Chromatogr A. 2010;1217:7677–89
8. Scott RPW, Simpson CF. J Chromatogr Sci. 1982;20:62–66
9. Fountain KJ et al. J Chromatogr A. 2009;1216:5979–88