Simultaneous Quantification of Saxagliptin, 5-Hydroxy Saxagliptin, and Dapagliflozin in Human Plasma Using SPE and UPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

V léčbě diabetu 2. typu hraje klíčovou roli kombinace DPP-4 inhibitorů a SGLT2 inhibitorů. Saxagliptin a dapagliflozin zajišťují komplementární mechanismy ke kontrole glykémie. Citlivá, přesná a rychlá kvantifikace těchto látek v lidské plazmě je nepostradatelná pro farmacokinetické studie, vývoj léčiv a monitorování terapie.

Cíle a přehled studie / článku

Navrhnout a validovat jednoduchou, vysoce selektivní metodu pro simultánní stanovení saxagliptinu, jeho aktivního metabolitu 5-hydroxy saxagliptinu a dapagliflozinu v lidské plazmě. Metoda kombinuje rychlou přípravu vzorku v 96-well µElution formátu a vysoce výkonnou chromatografii UPLC–MS/MS s pětiminutovým analytickým během.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class FTN System
• Xevo TQ-S micro tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr
• ACQUITY UPLC HSS C18 kolona (2.1×100 mm, 1.8 µm)
• Oasis MCX 96-well µElution SPE destička
• ACQUITY 96-well sběrná destička

Použitá metodika

Vzorky lidské plazmy byly naspikovány standardy (0.146–300 ng/mL). 300 µL plazmy bylo okyseleno 2% formou vodného roztoku kyseliny mravenčí a extrahováno pomocí mixed-mode SPE:

• Podmínění kartridže metanolem a vodou
• Naložení vzorku a praní vodným roztokem kyseliny mravenčí a metanolem
• Eluce 5% amoniaku v acetonitrilu, ředění vodou a injekce do autosampleru

Chromatografie:

• Mobilní fáze A: 2 mM octan amonný ve vodě, fáze B: acetonitril
• Gradient 5–95 % B během 2,5 min, flow 0,4 mL/min, kolona 40 °C, běh 5 min

MS/MS podmínky:

• Režimy ESI+ a ESI–, kapilární napětí +3,0/-2,8 kV
• MRM přechody: saxagliptin 316.22>180.19, 5-hydroxy saxagliptin 332.30>196.20, dapagliflozin 467.22>329.15
• Desolvace 550 °C, plyn 900 L/h

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje dolních mezí kvantifikace (LLOQ) 0,150 ng/mL pro saxagliptin, 0,200 ng/mL pro 5-hydroxy metabolit a 0,600 ng/mL pro dapagliflozin. Průměrné výtěžnosti extrakce jsou 100 % (saxagliptin), 71 % (5-hydroxy saxagliptin) a 59 % (dapagliflozin). Kalibrační křivky vykazují lineární oblast s R2 > 0,99 (váha 1/x2). Mezi- a nitrodobé přesnosti a přesnosti jsou v souladu s regulatorními požadavky (RSD ≤ 10 %, přesnost 95–105 %). S/N při LLOQ je významně vysoké pro všechny analyty.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoká propustnost a krátký analýzní čas (5 min) umožňují rychlé zpracování velkých sérií vzorků v bioanalýze a klinických studiích. Smíšená SPE zajišťuje selektivní čištění, minimalizuje matrix efekty a zvyšuje citlivost. Metoda je ideální pro farmakokinetické studie, vývoj generik i kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se další rozšíření multiplexních metod pro více analyzátů, automatizace přípravy vzorku a zmenšování objemů pomocí µElution formátů. Využití vysokorychlostní UPLC–MS/MS techniky bude klíčové pro personalizovanou medicínu a monitorování biologických markerů v reálném čase.

Závěr

Navržená metoda pro simultánní kvantifikaci saxagliptinu, jeho 5-hydroxy metabolitu a dapagliflozinu v lidské plazmě se vyznačuje vysokou citlivostí, přesností, rychlostí a selektivitou. Díky jednoduché přípravě vzorku a krátkému analytickému běhu je plně vhodná pro výzkum a klinické aplikace.

Reference

1. Xu XS et al. Liquid Chromatography and tandem mass spectrometry method for the quantitative determination of saxagliptin and its major pharmacologically active 5-monohydroxy metabolite in human plasma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;889-890:77–86.
2. Shubrook J et al. Saxagliptin: A Selective DPP-4 Inhibitor for the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Med Insights Endocrinol Diabetes. 2011;4:1–12.
3. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, CDER.