Development of Simple, Fast SPE Protocols for Basic Analyte Extraction with Phospholipid Removal Using Oasis PRiME MCX

Význam tématu

Analýza biologických vzorků pomocí LC-MS/MS je klíčová pro stanovení léčiv a dalších bioaktivních látek. Endogenní fosfolipidy v plasmě působí silné matriceové efekty, které ovlivňují ionizaci analyzovaných látek, snižují citlivost metody a zkracují životnost chromatografických kolonek. Vývoj jednoduchých a rychlých SPE protokolů s vysokou účinností při odstranění fosfolipidů je proto zásadní pro přesné a reprodukovatelné výsledky v bioanalytice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a optimalizovat SPE postup využívající nový sorbent Oasis PRiME MCX (RP/SCX), který zajistí účinné odstranění fosfolipidů z krevní plazmy při extrakci zásaditých analytů. Studie porovnávala standardní Oasis MCX 2×4 protokol s modifikovanými Oasis PRiME MCX protokoly ve formě 4-krokového a zjednodušeného 3-krokového postupu.

Použitá metodika a instrumentace

Studie byla rozdělena do dvou experimentálních částí:

• Vzorek 1: Standardní roztok fosfatidylcholinu (PC) pro sledování fází SPE a kvantifikaci PC ve frakcích UV detekcí.
• Vzorek 2: Krytá plazma potkana s panelem 15 zásaditých analytů pro hodnocení účinnosti extrakce a zbytku fosfolipidů pomocí LC-MS/MS.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class se systémem PDA detektoru a kolonkami BEH C8 (2.1×50 mm, 1.7 µm) a BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm)
• Xevo TQ-S tandemový hmotnostní spektrometr s pozitivní elektrospray ionizací (ESI+) a MRM režimem
• SPE produkty: Oasis PRiME MCX a standardní Oasis MCX cartridge a 96-well destičky
• Software: Empower 3 CDS a MassLynx v4.1

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání standardního Oasis MCX 2×4 protokolu s Oasis PRiME MCX ukázalo:

• Standardní protokol: cca 85 % PC se objevilo až ve finální eluční frakci, vysoké množství fosfolipidů zůstávalo až do elučního kroku.
• Oasis PRiME MCX 4-krokový protokol: přidaný vodný wash s 100 mM amonného formiátu zachytil 89 % PC v organickém wash kroku, do eluátu proniklo jen 0,8 % PC.
• Oasis PRiME MCX 3-krokový protokol: zjednodušením load fáze s 200 mM formiátu bylo možné vynechat vodný wash bez výrazné ztráty účinnosti, zůstalo ~2× méně fosfolipidů než u standardního protokolu.
• Analytické obnovy 15 zásaditých látek s pKa > 5 dosáhly u obou PRiME protokolů > 90 %, jen u diazepamu (pKa 3,4) došlo ke ztrátám ve vodném wash kroku.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované SPE protokoly Oasis PRiME MCX přinášejí dramatické snížení matriceových efektů díky výrazné redukci fosfolipidů ve vzorku, což vede k:

• Větší citlivosti a přesnosti kvantifikace zásaditých analytů v biologických maticích
• Prodloužení životnosti UPLC kolonek a snížení frekvence čištění systému
• Zjednodušení a zrychlení přípravy vzorků díky redukci pracovních kroků (3-krokový režim)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že podobné principy mixed-mode SPE budou dále rozvíjeny:

• Adaptace protokolů pro další třídy látek s různou polaritou a ionizačními vlastnostmi
• Integrace SPE do automatizovaných pracovních postupů pro vysokoproduktivní laboratoře
• Rozšíření využití pro klinické a toxikologické aplikace vyžadující vysokou citlivost a reprodukovatelnost

Závěr

Nové SPE protokoly založené na Oasis PRiME MCX umožňují efektivní odstranění fosfolipidů z krevní plazmy při zachování vysokých výtěžků zásaditých analytů. Zkrácené a zjednodušené postupy přinášejí rychlejší přípravu vzorků, nižší matriceové efekty a vyšší provozní spolehlivost LC-MS/MS systémů, což je významný přínos pro bioanalytické laboratoře.

Reference

1. Hall T. G. et al. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and Development. In Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles; InTech, 2012.
2. Michopoulos F. et al. Extraction Methods for the Removal of Phospholipids and other Endogenous Material from a Biological Fluid. Bioanalysis 2011, 3, 2747–2755.
3. Chambers E. et al. Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC-MS/MS analyses. J. Chromatogr. B 2007, 852, 22–34.
4. Neville D. et al. Efficacy of Plasma Phospholipid Removal During Sample Preparation and Subsequent Retention Under Typical UHPLC Conditions. Bioanalysis 2012, 4, 795–807.
5. Garrett E. R. et al. High performance liquid chromatographic assays of “Ecstasy”: stability, partitioning and plasma protein binding. Acta Pharm. Nord. 1991, 3, 9–14.
6. Ismaiel O. A. et al. Investigation of Endogenous Blood Plasma Phospholipids, Cholesterol and Glycerides that Contribute to Matrix Effects in Bioanalysis by LC-MS. J. Chromatogr. B 2010, 878, 3303–3316.
7. Arsenault J. C. Beginner’s Guide to SPE; Waters Corp., 2012.
8. Petelska A. D., Figaszewski Z. A. Effect of pH on the Interfacial Tension of Lipid Bilayer Membrane. Biophys. J. 2000, 78, 812–817.
9. Naumowicz M. et al. Electrochemical Impedance Spectroscopy for Examination of Acid–Base Equilibria at Phosphatidylcholine Bilayer Interface. Electrochim. Acta 2013, 91, 367–372.
10. Oasis Cartridge and 96-Well Plate Care and Use Manual; Waters Corp., 2017.
11. Zhang X. et al. Simple, Fast, and Clean Extraction of Synthetic Cannabinoids from Whole Blood Using Oasis PRiME HLB. Waters Corp., 2015.