COMPARISON OF SPE PROTOCOLS FOR PHOSPHOLIPID REMOVAL IN BASIC ANALYTE BIOANALYTICAL QUANTITATION

Význam tématu

Phospholipidy jsou klíčovými složkami buněčných membrán s významnou rolí ve funkčních i energetických procesech. Jejich rozmanitost a přítomnost v biologických matricích však při LC-MS analýzách způsobuje výrazné matriční efekty, které snižují přesnost kvantifikace sledovaných sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Práce porovnává účinnost dvou mixed-mode reverzní fáze/kationtové výměny SPE protokolů (Oasis MCX a Oasis PRiME MCX) zaměřených na selektivní odstranění hlavních tříd fosfolipidů a cholesterolu z lidské plazmy i standardních roztoků.

Použitá metodika a instrumentace

• SPE: Oasis MCX a Oasis PRiME MCX sorbenty (30 mg, 96 well)
• Vzorek: lidská plazma zředěná 4% H3PO4
• Kroky: načtení, vodné promývání (2% formiát amonný/2% formiová kyselina), organické promývání (methanol), eluce (5% NH4OH v methanolu)
• LC-MS/MS: ACQUITY UPLC I-CLASS + XEVO TQ-S, ESI+, MRM (monitoring PG, PI, PE, PS, PC, LPC, SM, cholesterol)
• Software: MassLynx v4.1

Hlavní výsledky a diskuse

• PG a PI: >95 % PG odstraněno v organickém wash kroku, PI se neudrží a eluováno již v load kroku.
• Cholesterol: efektivní odstranění během vodného i organického wash kroku díky převážně hydrofobní interakci.
• PE a PS: u Oasis MCX retence až do eluce, u Oasis PRiME MCX >95 % odstranění již v promývacích krocích vlivem zvýšeného pH a iontové síly.
• PC, LPC, SM: Oasis MCX zadržuje část sloučenin až do elučního kroku, Oasis PRiME MCX dosahuje >95 % odstranění v wash krocích díky částečné konverzi na zwitteriony.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované SPE protokoly minimalizují matriční efekt a umožňují přípravu čistších vzorků pro LC-MS kvantifikaci, což zvyšuje robustnost, citlivost a reprodukovatelnost bioanalytických metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra cílených lipidů a dalších interferentů
• Automatizace SPE procesů a integrace s on-line LC-MS
• Vývoj nových sorbentů pro selektivní separaci
• Implementace v klinických a farmaceutických laboratořích pro vysokopropustné analýzy

Závěr

Oasis PRiME MCX prokázal vyšší účinnost v odstranění hlavních fosfolipidů a cholesterolu v porovnání s Oasis MCX, čímž poskytuje čistší vzorky pro LC-MS analýzu a zlepšuje spolehlivost bioanalytických metod.

Reference

• [1] Journal of Lipid Research, 51 (2010) 3299.
• [2] Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407 (2015) 5227.
• [3] Marsh D. Handbook of Lipid Bilayers, CRC Press, Boca Raton (1990).
• [4] Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examination, 3rd ed., Chapter 31.