Quantification of Rituximab in Plasma Using an Automated and Standardized Kit-Based Approach

Význam tématu

Monoklonální protilátky jako rituximab hrají klíčovou roli v terapii onkologických a autoimunitních onemocnění. Kvalitní kvantifikace v biologických matricích vyžaduje citlivé, selektivní a reprodukovatelné postupy. S narůstajícím počtem biosimilárních produktů se zvyšuje tlak na rychlý vývoj robustních analytických metod.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat plně automatizovaný, sada-založený postup pro kvantifikaci rituximabu v plazmě s minimální manuální manipulací. Metoda kombinuje imunopurifikaci, tryptickou digesci a SPE čištění peptidů na platformě Hamilton Microlab STAR.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval následující kroky:

• Imunopurifikace rituximabu z malých objemů plazmy (28 µL) pomocí Protein A destičky.
• Tryptická digesce s využitím ProteinWorks Auto-eXpress Low 5 Digest kitu.
• Čištění peptidů pomocí ProteinWorks µElution SPE Clean-Up kitu.
• Chromatografická separace na ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 kolonu (300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm).
• Detekce a kvantifikace peptidů na Xevo TQ-S triple kvadrupólu s ESI+.

Použitá instrumentace:

• Hamilton Microlab STAR liquid handler
• ProteinWorks Auto-eXpress Digest Kit
• ProteinWorks µElution SPE Clean-Up Kit
• ACQUITY UPLC System a Peptide BEH C18 kolona
• Xevo TQ-S Mass Spectrometer

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní meze kvantifikace (LLOQ) 0,1 µg/mL s lineárním rozsahem přes 3,5 řádu velikosti. Průměrné přesnosti standardních křivek se pohybovaly mezi 100–102 % a koeficient variability QC vzorků byl < 5 %. Celkový čas přípravy vzorků (imunopurifikace, digesce, SPE) byl pod 8 hodin, což umožnilo analýzu ve stejný den.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená propustnost laboratoře díky plné automatizaci a předpřipraveným reagentům.
• Snížení rizika lidských chyb a variability mezi operátory.
• Minimální objem vzorku a vysoká citlivost vhodné pro farmakokinetické a biosimilární studie.
• Univerzální protokol lze snadno adaptovat pro další monoklonální protilátky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizovaných, modulárních sad pro komplexní přípravu biologických vzorků. Integrace vyšší míry multiplexingu a pokročilých MS platforem (např. HRMS) umožní simultánní analýzu více protilátek a jejich modifikací. Trendem je rovněž miniaturizace a integrované lab-on-a-chip systémy.

Závěr

Studie prokázala, že sada-založený, automatizovaný workflow pro kvantifikaci rituximabu poskytuje vynikající analytický výkon s vysokou citlivostí, lineárností a reprodukovatelností. Metoda je vhodná pro akceleraci vývoje a validace bioanalytických metod v biopharma průmyslu.

Reference

1. The Pharma Letter. Global Monoclonal Antibodies Market Set to Grow to $138.6 Billion by 2024. 2016.
2. Biogen Idec. RITUXAN (rituximab) United States Package Insert. 2016.
3. McKinsey & Company. Data Source: Evaluate Pharma, US Patent Expiration Dates.
4. FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, CDER. 2018.