BIOMINERALIZACE SRDEČNÍCH CHLOPNÍ

Význam tématu

Ve vyspělých zemích představuje aortální stenóza nejčastější operovanou srdeční vadu s náklady v řádu miliard dolarů ročně. Degenerativní kalcifikační procesy úzce souvisejí s tvorbou fosfátových usazenin v chlopenní tkáni, což vede k narušení normální hemodynamiky a postupnému selhání srdeční komory.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo objasnit proteomické složení fosfatovaných aortálních chlopní pacientů s aortální stenózou. Autoři aplikovali metodu peptidového mapování spojenou s moderními LC-MS/MS technologiemi na pevné nerozpustné vzorky chlopenní tkáně, aby identifikovali proteiny podílející se na procesu biomineralizace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky dvaceti patologicky postižených chlopní byly expedovány z kardiologické kliniky a skladovány při –20 °C. Pro proteolytickou analýzu bylo porovnáno dva přístupy:

• Redukce disulfidických můstků (dithiotreitol), následná alkylace (jodacetamid) a štěpení trypsinem.
• Štěpení trypsinem bez předchozího ošetření.

Výhodou přímého štěpení byla rychlost a vyšší podíl identifikovaných nerozpustných proteinů. Peptidové směsi byly čistěny ZipTip reverzní fází a analyzovány LC-MS/MS.

Použitá instrumentace

• UPLC Acquity (Waters) s ESI-Q-TOF (Waters, UK)
• UHPLC Dionex Ultimate3000 RSLC nano s ESI-Q-TOF Maxis Impact (Bruker Daltonics, Germany)
• ZipTip C18 reverzní fáze (Millipore)
• Software PLGS 2.3, Mascot 2.2.04, Data Analysis 4.1

Hlavní výsledky a diskuse

Celkem bylo identifikováno až 200 proteinů, z nichž ~30 % představovaly nekonvenční faktory biomineralizace. Mezi nejčastěji nalezené patřily:

• Alkalická fosfatasa – klíčová v mineralizačních procesech
• Osteopontin – vazba na hydroxyapatit a regulace krystalizace
• Biglykan, mimekan a periostin – modulace extracelulární matrix a růst kostní hmoty
• Proteoglykan 4 – zprostředkování ukládání minerálů v pojivové tkáni

Výsledky naznačují, že fosfátová mineralizace chlopní probíhá podobně jako osteogeneze, což otevírá cestu k novým diagnostickým a terapeutickým strategiím.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda peptidového mapování na nerozpustných vzorcích:

• Nevyžaduje demineralizaci ani komplexní chemickou úpravu.
• Umožňuje identifikaci neznámých proteinů a rychlou proteomickou charakterizaci.
• Je efektivní alternativou k imunohistochemii či gelové elektroforéze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími kroky jsou kvantifikace klíčových proteinů (např. SRM/MRM), validace biomarkerů pro časné odhalení kalcifikace a vývoj personalizované medikace. Metodu lze rozšířit na jiné formy patologických kalcifikací a kombinovat s imaging mass spectrometry pro prostorovou lokalizaci minerálů.

Závěr

Peptidové mapování spojené s LC-MS/MS prokázalo vysokou účinnost při analýze minerálů aortálních chlopní. Identifikované proteiny odhalují podobnosti s kostním metabolismem a poskytují nové cíle pro diagnostiku i léčbu aortální stenózy.

Reference

1. Čerbák R. Interv. Akut. Kardiol. 4, 203 (2005).
2. Šteiner I., Krbal L., Dominik J. Čes.-Slov. Patol. 46, 33 (2010).
3. Rajamannan N. M. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 2, 845 (2004).
4. Rosenhek R. et al. Circulation 110, 1291 (2004).
5. Antonini Canterin F. et al. Ital. Heart J. 6, 119 (2005).
6. Borer J. S. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25, 476 (2005).
7. Peltier M. et al. Arch. Mal. Coeur Vaiss. 97, 327 (2004).
8. Fusaro M. et al. J. Endocrinol. Invest. 34, 317 (2011).
9. Theuwissen E., Smit E., Vermeer C. Adv. Nutr. 3, 166 (2012).
10. Brázda O. Medical Tribune 12, C7 (2008).
11. Strunecká A., Patočka J., Limeback H. Klin. farmakol. a farmacie 19, 49 (2005).
12. Strunecká A., Patočka J. In: Structure and Bonding. New Developments in Biological Aluminum Chemistry, vol.2, s.139, Springer-Verlag, Berlin (2003).
13. Lehmann S. et al. Ann. Thorac. Surg. 88, 1476 (2009).
14. Kadena J. et al. Cardiovasc. Pathol. 14, 80 (2005).
15. Hynek R. et al. J. Surf. Anal. 17, 310 (2011).
16. Hynek R. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18, 1896 (2004).
17. Kuckova S. et al. Int. J. Mass Spectrom. 284, 42 (2009).
18. Kučková Š. et al. J. Cultural Heritage 10, 244 (2009).
19. Velčovská M. Bakalářská práce, VŠCHT Praha (2011).
20. Zeman A. et al. GEOMED 2011, Bari, Italy, s.267.
21. Biochemická cvičení, dostupné online http://biomikro.vscht.cz, staženo 2011.