STANOVENÍ ENANTIOMERŮ THEANINU POMOCÍ HPLC, POROVNÁNÍ METOD DETEKCE

Význam tématu

Theanin je neproteinogenní aminokyselina obsažená v lístcích čajovníku, která se vyskytuje jako pár enantiomerů L a D. L-theanin je spojován s příznivými účinky na krevní tlak, paměť či snižování stresu, zatímco farmakologické vlastnosti D-theaninu nejsou dostatečně prozkoumány. V potravinových doplňcích se často vyskytují racemáty, a proto je klíčová enantiomerní analýza pro zajištění kvality a bezpečnosti výrobků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat chromatografickou separaci enantiomerů theaninu metodou HPLC bez derivatizace i po derivatizaci činidly FMOC-Cl a dansyl chloridem. Dále se stanovily limity detekce a stanovitelnosti a ověřila se metoda na komerčním doplňku dostupném v České republice.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala přípravu standardů theaninu a derivatizaci:

• Chirální kolona Chirobiotic T (teikoplanin na silikagelu, 250 × 4,6 mm, 5 µm)
• Mobilní fáze: MeOH/voda 60/40 pro direktní analýzu; MeOH/1 % TEAA pH 6 v poměru 30/70 pro FMOC-deriváty; MeOH/1 % TEAA pH 6 v poměru 40/60 pro dansyl-deriváty
• Derivatizace FMOC-Cl: reakce 20 min v 0,2 M NaHCO3 pH 9,0
• Derivatizace dansyl-Cl: reakce při laboratorní teplotě 14 h
• Detekce UV: 205, 262 a 254 nm; fluorescenční: 254/314 nm a 340/516 nm
• HPLC Breeze: pumpa 1525, odplyňovač, autosampler 717, termostat Jetstream 2 Plus, UV/VIS detektor 2487, software Breeze
• Fluorescenční HPLC: pumpa Crystal 200, detektor FL 2000, odplyňovač CSI6150, ventil Rheodyne 5 µl, software Clarity
• Další pomůcky: pH metr PHM 220, centrifuga Eppendorf 5418, filtry 0,45 µm

Hlavní výsledky a diskuse

• Direktní separace enantiomerů na MeOH/voda 60/40 umožnila jejich spolehlivé rozlišení při UV detekci 205 nm
• FMOC-deriváty se optimálně oddělily na MeOH/1 % TEAA pH 6 (30/70) s dostatečným rozlišením a symetrickými píky
• Dansyl-deriváty vykázaly nejvyšší výtěžnost při 14 h RT a nejlepší separaci na MeOH/1 % TEAA pH 6 (40/60)
• Limity detekce LOD a stanovitelnosti LOQ:
  – Direktní UV: LOD 255 ng/ml (L), 568 ng/ml (D)
  – FMOC UV: LOD 9,5 ng/ml (L), 37,7 ng/ml (D)
  – FMOC fluorescenční: LOD 0,755 ng/ml (L), 4,26 ng/ml (D)
  – Dansyl UV: LOD 17,7 ng/ml (L), 25,9 ng/ml (D)
  – Dansyl fluorescenční: LOD 584 ng/ml (L), 832 ng/ml (D)
• Analýza komerčního doplňku nepotvrdila přítomnost D-theaninu nad stanovenými LOD

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná HPLC metoda poskytuje vysokou enantioselektivitu a citlivou kvantifikaci theaninu pro kontrolu kvality potravinových doplňků a farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HPLC s hmotnostní spektrometrií pro potvrzení struktur
• Automatizace a zkrácení derivatizačních kroků
• Rozšíření metod na další chirální aminokyseliny
• Rutinní QC nutraceutik a léčivých přípravků
• In vivo farmakokinetické studie enantiomerů

Závěr

Práce prokázala efektivní enantioseparační postupy theaninu bez derivatizace i s derivatizací FMOC-Cl a dansyl chloridem. Nejvyšší citlivosti dosahuje FMOC-fluorescenční detekce. Metoda byla úspěšně ověřena na komerčním doplňku, kde byla potvrzena čistota L-enantiomeru.

Reference

1. Ekborg-Ott K H, Taylor A, Armstrong D W: J Agric Food Chem 45, 353 (1997)
2. Gilbert M: Natural Foods Merchandiser 25, 46 (2008)
3. Srkalová S, Kalíková K, Tesařová E: Chem Listy 102, 480 (2008)
4. Zahradníčková H, Hartvich P, Holoubek I: Chem Listy 99, 703 (2005)
5. Desai M J, Armstrong D W: Rapid Commun Mass Spectrom 18, 251 (2004)
6. Desai M J, Gill M S, Hsu W H, Armstrong D W: Chirality 17, 154 (2005)
7. Sari F, Velioglu Y S: J Food Compos Anal 24, 1130 (2011)
8. Pittler E, Schmid M G: Biomed Chromatogr 24, 1213 (2010)
9. Minocha R, Long S: J Chromatogr A 1035, 63 (2004)
10. Subramanian G: Chiral Separation Techniques a Practical Approach str 1–2 Wiley-VCH Berlin 2007
11. Repko P: Diplomová práce Univerzita Karlova v Praze Praha 2011
12. Bosch L, Alegría A, Farré R: J Chromatogr B 831, 176 (2006)
13. Suna S, Lina Y, Wenga Y, Chen M: J Food Compos Anal 19, 112 (2006)
14. Bank R A, Jansen E J, Beekman B, Koppele J M: Anal Biochem 240, 167 (1996)
15. Jámbor A, Molnár-Perl I: J Chromatogr A 1216, 3064 (2009)
16. Lee W Y, Nieman T A: J Chromtogr A 659, 111 (1994)
17. Kang X, Xiao J, Huang X, Gu Z: Clin Chim Acta 366, 352 (2006)
18. Jonesa D P, Carlsona J L, Samieca P S, Sternberg P, Mody V C, Reed R L, Brown L A S: Clin Chim Acta 275, 175 (1998)
19. Čížková H, Ševčík R, Rajchl A, Pivoňka J, Voldřich M: Chem Listy 106, 903 (2012)