IZOLACE A STANOVENÍ LAKTOFERINU Z LIDSKÝCH SLIN

Význam tématu

Sliny představují bohatý zdroj biologicky aktivních proteinů, mezi které patří laktoferin – glykoprotein s antimikrobními, protizánětlivými a imunitu modulujícími vlastnostmi. Jeho stanovení ve slinách je cenným indikátorem zánětlivých a imunitních procesů v organismu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat spolehlivou metodu pro izolaci a kvantifikaci laktoferinu z lidských slin kombinací iontově výměnné kapalinové chromatografie na monolitické kolonce a off-line fotometrického stanovení pomocí Bradfordovy metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Iontově-výměnná kapalinová chromatografie Biologic DuoFlow (Biorad) s monolitickou CIM disk kolonkou modifikovanou sulfokyselinovými skupinami, UV-VIS detektorem (280 nm) a automatickým sběračem frakcí.
• Off-line fotometrické stanovení koncentrace laktoferinu na spektrofotometru BS-200 (Mindray) porovnáním Bradfordovy, biuretové a pyrogalové metody.
• SDS-PAGE elektroforéza (Maxigel, Biometra) pro kontrolu homogenity a čistoty izolovaného proteinu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Bradfordova metoda vykázala nejlepší analytické parametry (lineární rozsah 0,1–62,5 µg/ml, LOD 0,01 µg/ml, RSD 4 %).
• Návratnost izolace laktoferinu ze slin činila (53 ± 5) %.
• V průměru zdravých osob (n=9) činila koncentrace laktoferinu ve slinách 42 ± 4 µg na mg celkových proteinů.
• Pacientka s celiakií vykázala 2,5× vyšší hladinu laktoferinu než zdravé kontroly, což koreluje se zánětlivou aktivací střevní sliznice.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená kombinace monolitické chromatografie a off-line fotometrie nabízí selektivní izolaci laktoferinu při zachování konformační integrity proteinu, nízký limit detekce a možnost plné automatizace pro rutinní klinická a výzkumná měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

• On-line propojení chromatografie s fotometrickou detekcí pro zkrácení analytického času.
• Miniaturizace detekčních systémů a využití elektrochemických senzorů pro bodové testy u pacientů.
• Rozšíření analýzy o další biomarkery ve slinách pro komplexní diagnostiku zánětlivých a imunitních stavů.

Závěr

Vyvinutá metoda integrující monolitickou iontově výměnnou chromatografii a Bradfordovu fotometrii je robustní, citlivá a snadno automatizovatelná pro stanovení laktoferinu ve slinách s využitím v klinické i průmyslové praxi.

Reference

1. Skaličková S., Zítka O., Křížková S., Vlková M., Sochor J., Adam V., Kizek R.: Isolace a stanovení laktoferinu z lidských slin. Chemické listy 108, 56–63 (2014).