VALIDÁCIA STANOVENIA 1-HYDROXYPYRÉNU V MOČI METÓDOU HPLC

Význam tématu

Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) představují významné karcinogenní riziko v pracovním i životním prostředí. Mezi nejčastěji sledované biomarkery expozice PAU patří 1-hydroxypyrén (1-HOP) v moči, derivát pyrenu vznikající po biotransformaci a konjugaci s kyselinou glukuronovou. Jeho spolehlivé stanovení pomáhá při hodnocení profesionální expozice v průmyslových provozech a monitorování účinnosti ochranných opatření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo validovat již publikovanou metodu na stanovení 1-HOP v moči pracovně exponovaných osob technikou HPLC s fluorescenční detekcí. Validace podle ICH Q2(R1) zahrnuje stanovení linearity, citlivosti, přesnosti, správnosti, robustnosti i účasti na externím hodnocení kvality.

Použitá instrumentace

• HPLC Shimadzu LC-20 Prominence s fluorescenčním detektorem RF-10 AXL (Ex 242 nm, Em 388 nm)
• Analytická kolona Discovery HS C18 (15 cm × 4,6 mm, 5 μm) a předkolona Supelguard Discovery C18
• Vacuum manifold Visiprep SPE (LiChrolut RP-18, 100 mg)
• Ultrazvuková lázeň Elmasonic S15H, trepací vodní lázeň GFL 1083

Použitá metodika

• Vzorek moči (5 ml) se smíchal s 5 ml 0,2 M octanového pufru (pH 5) a enzymaticky hydrolyzoval 16 h při 37 °C (β-glukuronidáza/arylová sulfatáza)
• SPE extrakce z konjugátem zbavené moči: kondicionace kolony metanol–voda, aplikace vzorku, promytí vodou, eluční metanol (1 ml)
• Chromatografie: mobilní fáze acetonitril : vodá (60 : 40, v/v), průtok 1,0 ml/min, teplota kolony 30 °C, objem injekce 30 μl

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah 0,5–20 μg/l (r = 0,9994)
• Limit detekce (LOD) 0,08 μg/l, limit stanovitelnosti (LOQ) 0,26 μg/l
• Přesnost (RSD) opakovatelnosti a reprodukovatelnosti < 9,8 %
• Správnost (recoveries) 78,8–93,5 % při analýze referenčních materiálů
• Robustnost: malé změny mobilní fáze (±2 % acetonitrilu) či teploty kolony (±2 °C) neovlivnily významně retenční čas ani plošný signál
• Externí hodnocení G-EQUAS 2013 – výsledky zařazeny do přijatelného rozmezí

Přínosy a praktické využití metody

Validovaná HPLC metoda umožňuje citlivé a spolehlivé stanovení 1-HOP v moči v rutinní klinické a průmyslové praxi. Díky jednoduché preanalytické přípravě (enzymatická hydrolýza + SPE) a fluorescenční detekci lze monitorovat nízké koncentrace biomarkeru a porovnávat je s legislativními biologickými medzními hodnotami.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vzhledem k rostoucím požadavkům na biomonitoring lze metodu dále kombinovat s tandemovou hmotnostní detekcí (LC–MS/MS), optimalizovat rychlost analýzy či rozšířit panel biomarkerů PAU o další hydroxylované metabolity.

Závěr

Metoda HPLC s fluorescenční detekcí pro stanovení 1-HOP v moči byla úspěšně validována. Splňuje požadavky na citlivost, přesnost, správnost i robustnost a je vhodná pro rutinní biomonitoring expozice PAU.

Reference

1. Tuček M., Bencko V., Volný J., Petánová J.: Cesk. Prac. Lek. 2, 72 (2006).
2. Buchancová J. (ed.): Pracovné lekárstvo a toxikológia. Osveta, Martin (2003).
3. Strickland P., Kang D., Sithisarankul P.: Environ. Health Perspect. 104, 5 (1996).
4. Jongeneelen F. J.: Ann. Occup. Hyg. 45, 1 (2001).
5. Nariadenie vlády SR č. 471/2011 Z. z. o ochrane zamestnancov pred rizikami chemických faktorov pri práci.
6. Fan R. et al.: J. Chromatogr. B 836, 92 (2006).
7. Barek J. et al.: Chem. Listy 91, 871 (1997).
8. Yosypchuk O., Barek J.: Chem. Listy 104, 61 (2010).
9. Shahtaheri S. J. et al.: Iran. J. Public Health 35, 33 (2006).
10. Ichiba M. et al.: J. Occup. Health 49, 159 (2007).
11. Kawamoto T. et al.: J. Occup. Health 49, 183 (2007).
12. Chen H. W.: Anal. Sci. 23, 1221 (2007).
13. Pires de Rego E. C., Duarte Pereira Netto A.: IMEKO World Congress, 2613 (2009).
14. Van Rooij J. G. M., Jongeneelen F. J.: Int. Arch. Occup. Environ. Health 83, 105 (2010).
15. Ivan J. et al.: Prac. Lek. 63, 63 (2011).
16. Lee K. H., Byeon S. H.: Int. J. Environ. Res. 4, 439 (2010).
17. Shahtaheri S. J. et al.: Iran. J. Chem. Chem. Eng. 26, 75 (2007).
18. ICH Harmonised Tripartite Guideline Q2(R1), Validation of Analytical Procedures, Geneva (2005).
19. Pan C. H. et al.: Occup. Environ. Med. 65, 732 (2008).