NOVÁ METODA PRO IN VIVO MONITOROVÁNÍ MOLEKULÁRNÍ PODSTATY ZÁVISLOSTI NA DROGÁCH

Význam tématu

Metamfetamin představuje významný problém v oblasti drogové závislosti, ovlivňuje extracelulární hladiny monoaminů v mezolimbickém dopaminergním systému a může vést k nežádoucím účinkům včetně rizik pro plod při užívání těhotnými ženami. Detailní in vivo sledování dopaminu a jeho metabolitů v diskrétních oblastech mozku je klíčové pro pochopení molekulárních mechanismů závislosti a vývoj účinnějších terapeutických postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout citlivou a selektivní metodu pro monitoring dopaminu (DA) a jeho hlavních metabolitů (HVA, 3-MT, DOPAC) v extracelulárním prostoru nucleus accumbens potkanů in vivo, a aplikovat ji ve studii dopadů prenatální expozice metamfetaminu na dopaminergní systém dospělých jedinců.

Použitá metodika

Vzorky extracelulárního mokrého prostředí byly odebírány pomocí mikrodialýzy s polopropustnou membránou, stabilizovány přídavkem HCl, obohaceny o deuterovaný vnitřní standard a soustředěny lyofilizací. Analýza probíhala na systému HPLC-ESI-MS/MS s gradientní elucí a SRM detekcí:

• Odběr: Mikrodialýza, průtok 2 µl/min, interval 20 min
• Stabilizace: 0,1 M HCl, vnitřní standard DA.HCl-d4
• Zakoncentrování: Lyofilizace (–47 °C, 9 kPa)
• Separace: Kolona Gemini C18, 150×2 mm, gradient metanol/kyselina octová
• Detekce: TSQ Vantage, ESI+ pro DA a 3-MT, ESI– pro HVA a DOPAC, SRM módy

Použitá instrumentace

• Pumpy a autosampler: Thermo Scientific Accela 600 + Accela autosampler
• Kolony: Gemini C18 (Phenomenex) s předkolonkou Gemini C18
• Mass spektrometr: Thermo TSQ Vantage s elektrosprejovou ionizací
• Lyofilizátor: Labconco FreeZone
• Mikrodialyzační kanyla: MAB 4.15 IC a MAB 4.15.2.Cu (Agn Tho‘s AB)
• Stereotaktický aparát a halotanová anestézie

Hlavní výsledky a diskuse

Validace metody pro DA a jeho metabolity prokázala dobrou přesnost (RSD kolem 10–14 %), správnost (RE kolem –11 až –14 %), limity detekce 0,07–0,09 pg/40 µl a kvantifikace 0,08–0,11 pg/40 µl. V experimentu s potkany prenatálně vystavenými MA byly zaznamenány vyšší bazální koncentrace DA, HVA, 3-MT a DOPAC v nucleus accumbens a po akutním podání MA výraznější zvýšení DA, 3-MT a HVA ve srovnání s kontrolou.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivé in vivo sledování cholinergních a monoaminových mediatorů i jejich metabolitů v konkrétních mozkových oblastech za fyziologických podmínek i po podání psychoaktivních látek. Díky vysoké senzitiviti, selektivitě a možnosti přizpůsobení různým analyzům je vhodná pro farmakodynamické studie, neurochemii a vývoj nových léků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další neurotransmiterové systémy a malé peptidy
• Optimalizace časového rozlišení odběrů pro dynamické procesy
• Integrace s neurozobrazením a behaviorálními daty
• Aplikace v preklinických studiích neurodegenerativních onemocnění

Závěr

Předložená metoda spojuje mikrodialýzu, lyofilizaci a HPLC-ESI-MS/MS se SRM detekcí pro rychlou a precizní kvantifikaci dopaminu a jeho metabolitů in vivo. Aplikace ve studii prenatální expozice metamfetaminu ukázala trvalé změny v dopaminergním systému potomků. Metodika je univerzálně použitelná pro široké spektrum neurochemických analýz.

Reference

• Kršiak M.: Br. J. Pharmacol. 65, 525 (1979).
• Bubenikova-Valesova V. et al.: Int. J. Dev. Neurosci. 27, 525 (2009).
• Gough B. et al.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 965, 410 (2002).
• Di Chiara G., Bassareo V.: Curr. Opin. Pharmacol. 7, 69 (2007).
• Nestler E. J.: Nat. Neurosci. 8, 1445 (2005).
• Paxinos G., Watson C.: The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Elsevier 2003.
• Lange V. et al.: Mol. Syst. Biol. 4, 222 (2008).
• Westerink B. H.: J. Chromatogr. B 747, 21 (2000).
• Syslová K. et al.: J. Chromatogr. A 1218, 3382 (2011).
• Baranyi M. et al.: J. Chromatogr. A 1120, 13 (2006).
• Tsuchida K. et al.: Pharmacol. Biochem. Behav. 53, 575 (1996).