MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA BRONCHIÁLNÍHO ASTMATU ZALOŽENÁ NA OBSAHU CYSTEINYLOVANÝCH LEUKOTRIENŮ A LIPOXINŮ V KONDENZÁTU VYDECHOVANÉHO VZDUCHU

Význam tématu

Bronchiální astma patří mezi nejrozšířenější zánětlivá onemocnění dýchacích cest s milióny pacientů celosvětově. Přestože standardní diagnostika a léčba dokáží většině nemocných zajistit kvalitní život, zůstává část pacientů obtížně léčitelná a chybí spolehlivé neinvazivní biomarkery pro detekci a fenotypizaci onemocnění. Měření prozánětlivých cysteinylovaných leukotrienů (cys-LTs) a protizánětlivých lipoxinů (LXs) v kondenzátu vydechovaného vzduchu (KVV) nabízí nový pohled na rovnováhu zánětu a regenerace v plicích, umožňuje sledování průběhu astmatu a vyhodnocení účinnosti terapie.

Cíle a přehled studie

Práce se zaměřila na> vývoj molekulárně diagnostické metody pro simultánní kvantifikaci cys-LTs (LTC4, LTD4, LTE4) a LXs (LXA4, LXB4) v KVV astmatiků s různými fenotypy, zejména obtížně léčitelné astma (OLA), a na ověření schopnosti této metody:

• rozlišit jednotlivé fenotypy astmatu
• monitorovat účinnost steroidní farmakoterapie
• odlišit astma od chronické obstrukční nemoci plic (CHOPN)

Použitá instrumentace

• HPLC systém s kvartérní pumpou a autosamplerem (Thermo Scientific Accela)
• Kolonový termostat UltiMate 3000 (Dionex)
• Analytická kolona Hypercarb 100 × 2,1 mm, 5 µm
• Tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr TSQ Vantage s ESI v negativním módu
• Lyofilizátor Labconco Free Zone
• Zařízení pro odběr kondenzátu vydechovaného vzduchu chlazené na ‑20 °C

Použitá metodika

Vzorky KVV byly odebírány do chlazeného kondenzátoru, standardizováno 120 l vydechnutého vzduchu. Po přidání deuteriovaných interních standardů proběhlo lyofilizace, rekonstituce mobilní fází a izokratická HPLC separace (75 % propan-2-olu s 1 % kyseliny mravenčí / 25 % 10 mmol l–1 octanu amonného) při 40 °C a průtoku 150 µl min–1. Kvantifikace pomocí SRM monitorování charakteristických přechodů m/z pro každý analyty.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve skupině OLA astmatiků byly významně zvýšeny hladiny cys-LTs a současně sníženy LXs oproti zdravým kontrolám. Dynamická nerovnováha cys-LTs a LXs (princip houpačky) umožnila fenotypizaci:

• profesní astma
• středně těžké astma bez/ s glukokortikoidy
• obtížně léčitelné astma

Analýza shluků potvrdila i odlišení pacientů s různými způsoby podání steroidů (perorálně vs inhalačně). Další klastrování ukázalo schopnost odlišit astma od CHOPN.

Přínosy a praktické využití metody

• Neinvazivní odběr KVV umožňuje časté opakování měření a sledování dynamiky onemocnění
• Metoda podporuje personalizovanou péči o astmatiky
• Možnost včasné identifikace refrakterních pacientů a úpravy léčby
• Rozšíření na monitorování oxidačního stresu či jiných plicních onemocnění

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metody může zaměřit na:

• zařazení dalších molekul jako biomarkerů oxidačního stresu či zánětu
• automatizaci odběru a přípravy vzorků pro rychlé vyhodnocení v klinické praxi
• integraci dat z metabolomických profilů k hlubší fenotypizaci pacientů
• kombinaci s genetickými a imunitními markery pro komplexní diagnostiku dýchacích onemocnění

Závěr

Popsaná LC-ESI-MS/MS metodika pro stanovení cys-LTs a LXs v KVV představuje účinný nástroj pro fenotypizaci bronchiálního astmatu, monitorování účinnosti farmakoterapie i diferenciaci od CHOPN. Díky neinvazivnímu odběru a možnosti častého opakování nabízí značný potenciál pro personalizovanou péči a rozšíření do dalších oblastí respiratorní medicíny.

Reference

1. Holz O., Kips J., Magnussen H. European Respiratory Journal 16, 355 (2000)
2. Csoma Z., Kharitonov S. A., Balint B., Busch A., Wilson N. M., Barnes P. J. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 166, 1345 (2002)
3. Higashi N., Mita H., Ono E., Fukutomi Y., Yamaguchi H., Kajiwara K., Tanimoto H., Sekiya K., Akiyama K., Taniguchi M. Journal of Allergy and Clinical Immunology 125, 1084 (2010)
4. Chappell G. P., Xiao X., Pica-Mendez A., Varnell T., Green S., Tanaka W. K., Laterza O. Journal of Chromatography B 879, 277 (2011)
5. Syslova K., Kacer P., Kuzma M., Pankracova A., Fenclova Z., Vlckova S., Lebedova J., Pelclova D. Journal of Breath Research 4(1), 017104 (2010)
6. Sapey E. Bronchial Asthma: Emerging Therapeutic Strategies. InTech, Rijeka (2012)
7. Montuschi P. New perspectives in monitoring lung inflammation: Analysis of exhaled breath condensate. CRC Press, Boca Raton (2005)
8. Samitas K., Chorianopoulos D., Vittorakis S., Zervas E., Economidou E., Papatheodorou G., Loukides S., Gaga M. Respiratory Medicine 103, 750 (2009)
9. Syslová K., Kačer P., Kuzma M., Klusáčková P., Fenclová Z., Lebedová J., Pelclová D. Journal of Chromatography B 867, 8 (2008)