MIKRODIALÝZA A HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE JAKO KLÍČ K MONITOROVÁNÍ METABOLITŮ V NEZRALÉM MOZKU

Význam tématu

Perinatální vývoj mozku je spojen s rozsáhlými biochemickými a strukturálními změnami neurotransmiterových systémů a energetického metabolismu. Poruchy v tomto období mohou vést k trvalým neurologickým a kognitivním deficitům. Přímé sledování extracelulárních koncentrací klíčových metabolitů in vivo nabízí cenné informace pro diagnostiku, výzkum a volbu optimální terapie.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat protokol pro sledování extracelulárních koncentrací aminokyselin, monoaminů a organických kyselin v hipokampu 12denních potkanů pomocí mikrodialýzy v kombinaci s HPLC-MS.

Použitá instrumentace

• Mikrodialýza: sondy CMA7 (6 kDa), perfuzní pumpa a chlazený kolektor CMA microdialysis
• HPLC: Luna C8(2) 150 × 2,1 mm, 2,6 μm; pumpa Accela 600, autosampler Accela Open AS (Thermo Scientific)
• MS: LTQ Orbitrap Velos s elektrosprejovou ionizací (ESI+, ESI–), software Xcalibur

Metodika

Po stereotaktickém zavedení mikrodialyzační sondy do dorzálního hipokampu potkanů P12 byla perfuze umělým mozkomíšním mokem rychlostí 1,5 μl/min. Odebírané vzorky byly derivatizovány oktanoylchloridem ve Schotten–Baumannových podmínkách. Analýza probíhala gradientní elucí na HPLC a detekcí v Orbitrapu. Parametry ionizace a chromatografie byly optimalizovány pro nízké LOD a LOQ.

Hlavní výsledky a diskuse

Metodika dosahuje recovery 65–90 % pro sledované látky a umožňuje stanovit bazální koncentrace více než 20 metabolitů, např. glutamát 6,70 μM, glutamin 0,323 μM, laktát 3,9 μM, pyruvát 1,6 μM. Derivatizace zlepšuje separaci a snižuje detekční limity. In vivo odběry poskytují téměř on-line data a minimalizují invazivitu oproti biopsii.

Přínosy a praktické využití

• Vysoká selektivita a citlivost nad rámec standardních biochemických testů
• Možnost dynamického sledování metabolických změn in vivo
• Přímá informace z cílených mozkových oblastí

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší aplikace MD-HPLC-MS v neurovýzkumu i klinické praxi nezralého mozku. Vývoj automatizovaných derivatizačních postupů a komerčních kitů může umožnit rutinní monitoring perinatálních neuroporuch.

Závěr

Vyvinutá metodika kombinuje mikrodialýzu a HPLC-MS s vynikající selektivitou, citlivostí a reprodukovatelností. Umožňuje precizní mapování extracelulárního metabolismu v nezralém mozku a přináší nový nástroj pro výzkum vývojových i patologických procesů in vivo.

Reference

• Semple B. D. et al.: Prog. Neurobiol. 106–107, 1 (2013)
• Herlenius E., Lagercrantz H.: Exp. Neurol. 190, S8 (2004)
• Luján R. et al.: Neuroscience 130, 567 (2005)
• Ben-Ari Y. et al.: J. Physiol. 416, 303 (1989)
• Agrawal H. C. et al.: J. Neurochem. 13, 607 (1966)