Measurement of Enzymatic Activities in Dried Blood Spots with On-Line Solid Phase Extraction-LC/MS/MS System

Význam tématu

Lyzozomy jsou klíčové buněčné organely zodpovědné za odbourávání makromolekul pomocí hydroláz. Hodnocení jejich enzymatických aktivit přispívá k diagnostice a sledování lysosomálních onemocnění. Metoda online SPE-LC/MS/MS umožňuje rychlé a současné měření více enzymů v sušených krevních skvrnách (DBS) bez náročné předúpravy vzorku.

Cíle a přehled studie

Studie využívá protokol z Meyer Children’s Hospital ve Florencii k simultánnímu stanovení aktivit tří lyzozomálních enzymů: alpha-iduronidázy (IDUA), acid alpha-glukosidázy (GAA) a alpha-galaktosidázy A (GLA). Cílem je demonstrovat validní, citlivou a vysoce automatizovanou analýzu enzymových produktů v DBS pomocí LCMS-8050.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 3,2 mm diskety DBS v 96jádrové destičce, inkubace 22 h při 37 °C s odpovídajícími substráty a vnitřními standardy.
• Online SPE: Perfusion kolona POROS R1 pro zachycení a odsolení vzorku, eluace s 0,05 % HCOOH/5 mM HCOONH₄ a 0,1 % HCOOH/CH₃OH.
• HPLC separace: Shim-pack XR-ODS (75 × 2,0 mm, 2,2 µm), průtok 0,6 mL/min, doba analýzy 5,5 min, injekce 2 µL.
• MS/MS podmínky: LCMS-8050, ESI+ režim, interface 100 °C, DL 100 °C, Heat Block 100 °C, suchý plyn 15 L/min, nebulizační plyn 3 L/min, vyhřívací plyn 5 L/min.
• MRM monitoring: specifické přechody pro produkty (IDUA-P 391,2→291,2; GAA-P 498,4→398,3; GLA-P 484,3→384,3) a jejich deuterované interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala odlišné chromatografické píky u vzorků s chybějícími enzymy ve srovnání s kontrolou. Aktivita IDUA, GAA a GLA v kontrolních krevních skvrnách dosahovala přibližně 15,2; 6,0 a 10,1 µmol/h/L. Vzorky chybějící jednotlivý enzym vykázaly významně snížené hodnoty odpovídajících aktivit. Výpočty byly založeny na poměru produktu k internímu standardu, objemu reakčního roztoku a odběru krve z DBS.

Přínosy a praktické využití metody

Online SPE-LC/MS/MS výrazně zkracuje čas analýzy a eliminuje manuální čištění a odsolení. Multiplexní přístup umožňuje současné stanovení několika enzymev z jednoho vzorku, což zvyšuje efektivitu a diagnostickou spolehlivost laboratoří zabývajících se screeningem lyzosomálních poruch.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj plně automatizovaných platforem a rozšíření spektra stanovených enzymů mohou přispět k hromadnému screeningu novorozenců. Integrace s digitálními laboratorními informačními systémy a využití pokročilých algoritmů pro kvantifikaci umožní lepší sledování progresivních chorob a personalizovanou medicínu.

Závěr

Metoda online SPE-LC/MS/MS na platformě LCMS-8050 nabízí citlivé, rychlé a vysoce reprodukovatelné stanovení lyzozomálních enzymatických aktivit v sušených krevních skvrnách. Eliminuje potřebu složité předúpravy a podporuje multiplexní analýzu, což zvyšuje provozní efektivitu klinických i výzkumných laboratoří.

Reference

• la Marca G et al., Anal. Chem. 81 (2009) 6113-6121
• Ombrone D et al., Eur. J. Mass Spectrom. 19 (2013) 497-503