V <a href="https://lcms.cz/article/1731">prvním díle seriálu o řešení problémů v HPLC</a> jsme se podívali na základní tipy jak Váš HPLC systém provozovat a také osvědčené postupy pro odstraňování problémů, pokud se nakonec vyskytnou.
<a href="https://lcms.cz/article/1743">Druhý díl - chromatografické píky</a> přinesl detailnější pohled na problematiku chromatografických píků z pohledu chvostování nebo frontování, širokých píků, žádných píků, píků navíc nebo píků dvojitých.
<a href="https://lcms.cz/article/1767">Třetí díl seriálu</a> rozebral postupy v případě výskytu fluktuace retenčních časů, ztráty rozlišení, změny citlivosti, driftu základní linie nebo šumu základní linie.
Poslední, čtvrtý díl, se zaměří tlak a varianty nejběžnějších problémů s ním v HPLC spojených. Zodpovíme otázky typu: tlak není zobrazen, ale průtok je správný, Nízký tlak, Fluktuace tlaku, Vysoký tlak.
<blockquote>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Pruvodce_resenim_problemu_v_HPLC_zakladni_postup_8309b7ee11/Shimadzu-Pruvodce-resenim-problemu-v-HPLC-zakladni-postup.jpg" alt="Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC"/>
</blockquote>
<blockquote>
<h4><a href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_HPLC_Troubleshooting_CZ_Pruvodce_resenim_problemu_v_kapalinove_chromatografii_573693cdb3/Shimadzu-HPLC-Troubleshooting-CZ-Pruvodce-resenim-problemu-v-kapalinove-chromatografii.pdf">Kompletní příručka dostupná ke stažení v knihovně!</a></h4>
</blockquote>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Pruvodce_resenim_problemu_v_HPLC_Tlak_neni_zobrazen_ale_prutok_je_spravny_260717e5dc/Shimadzu-Pruvodce-resenim-problemu-v-HPLC-Tlak-neni-zobrazen-ale-prutok-je-spravny.jpg" alt="Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Tlak není zobrazen, ale průtok je správný"/>
<h3>Tlak není zobrazen, ale průtok je správný</h3>
<h5>Porucha snímače</h5>
<ul>
<li>Opravte nebo vyměňte snímač tlaku.</li>
</ul>
<h5>Nekompatibilita softwaru</h5>
<ul>
<li>Použijte alternativní software, který umožňuje záznam tlaku.</li>
</ul>
<h5>Proplachovací ventil ponechán otevřený</h5>
<ul>
<li>Zavřete ventil.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Pruvodce_resenim_problemu_v_HPLC_Nizky_tlak_d10e6553b5/Shimadzu-Pruvodce-resenim-problemu-v-HPLC-Nizky-tlak.jpg" alt="Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Nízký tlak"/>
<h3>Nízký tlak</h3>
<h5>Částečná netěsnost v systému</h5>
<ul>
<li>Zkontrolujte všechna připojení a utáhněte všechna netěsná místa.</li>
</ul>
<h5>Průtok</h5>
<ul>
<li>Zkontrolujte, zda je v metodě nastaven správný průtok.</li>
<li>Vyzkoušejte přesnost průtoku pomocí kalibrovaného průtokoměru, nebo změřte čas naplnění definovaného objemu.</li>
</ul>
<h5>Metoda</h5>
<ul>
<li>Ověřte, zda metoda používá správnou teplotu a správná rozpouštědla.</li>
</ul>
<h5>Špatná kolona</h5>
<ul>
<li>Použijte kolonu se správnými rozměry a geometrií částic.</li>
</ul>
<h5>Příliš vysoká teplota kolony</h5>
<ul>
<li>Nastavte odpovídající teplotu kolony a zkontrolujte, zda nedošlo k jejímu poškození, pokud dojde k překročení limitu teploty kolony.</li>
</ul>
<h5>Porucha snímače</h5>
<ul>
<li>Opravte nebo vyměňte snímač tlaku.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Pruvodce_resenim_problemu_v_HPLC_Fluktuace_tlaku_7a8fc261d9/Shimadzu-Pruvodce-resenim-problemu-v-HPLC-Fluktuace-tlaku.jpg" alt="Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Fluktuace tlaku"/>
<h3>Fluktuace tlaku</h3>
<h5>Vzduchové bubliny</h5>
<ul>
<li>Propláchněte cestu MF pro odstranění vzduchových bublin.</li>
</ul>
<h5>Opotřebení těsnění pumpy</h5>
<ul>
<li>Vyměňte těsnění.</li>
</ul>
<h5>Zkontrolujte ventily</h5>
<ul>
<li>Ultrazvukujte zpětné ventily v isopropanolu.</li>
<li>Pokud problém přetrvává, vyměňte zpětné ventily.</li>
</ul>
<h5>Netěsnosti</h5>
<ul>
<li>Poškození těsnění čerpadla může způsobit malé netěsnosti. Vyměňte těsnění. Zkontrolujte spojky.</li>
</ul>
<h5>Nedostatečné odplynění</h5>
<ul>
<li>Odplyňte rozpouštědlo, vyměňte frity mobilní fáze; je-li nutno opravte degasser.</li>
</ul>
<h5>Použití gradientové eluce</h5>
<ul>
<li>Cyklus tlaků způsobený změnami viskozity je normální, ale použijte přiměřeně velký objem mixéru.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Pruvodce_resenim_problemu_v_HPLC_Vysoky_tlak_bbc59b5562/Shimadzu-Pruvodce-resenim-problemu-v-HPLC-Vysoky-tlak.jpg" alt="Shimadzu: Průvodce řešením problémů v HPLC - Vysoký tlak"/>
<h3>Vysoký tlak</h3>
<h5>Nastaven vysoký průtok</h5>
<ul>
<li>Snižte nastavení průtoku</li>
</ul>
<h5>Ucpaná kolona</h5>
<ul>
<li>Propláchněte kolonu zpětným tokem (pokud lze), nebo ji vyměňte.</li>
</ul>
<h5>Nekompatibilní MF (sraženina pufru nebo nemísitelné složky)</h5>
<ul>
<li>Použijte správnou MF; propláchněte kolonu a znovu ekvilibrujte</li>
</ul>
<h5>Nesprávná kolona</h5>
<ul>
<li>Použijte kolonu správného rozměru a geometrie částic</li>
</ul>
<h5>Zablokovaný injektor</h5>
<ul>
<li>Odstaňte překážku (zkontrolujte jehlu, smyčku, ventil s HPV výstup).</li>
</ul>
<h5>Zablokovaná ochranná kolona/kartridž</h5>
<ul>
<li>Vyměňte nebo odstraňte guard kolonu</li>
</ul>
<h5>Zablokovaný in-line filtr</h5>
<ul>
<li>Vyměňte nebo odstraňte filtr.</li>
</ul>
<h5>Příliš nízká teplota kolony</h5>
<ul>
<li>Nastavte správnou teplotu.</li>
</ul>
<h5>Vadný senzor</h5>
<ul>
<li>Opravte nebo vyměňte snímač tlaku.</li>
</ul>
<h5>In-line filtr pumpy je zablokován</h5>
<ul>
<li>Vyměňte filtr</li>
</ul>

Průvodce řešením problémů v HPLC - Vysoký a nízky tlak, fluktuace

Toto video jsme vytvořili jako úvod pro techniku HPLC. Má poskytnout první představu o tom, co je to „vysokoúčinná kapalinová chromatografie“ (HPLC) a jaké jsou její možné aplikace. HPLC je definována jako „laboratorní technika separace směsi, při níž kapalná mobilní fáze přenáší analyt přes kolonu držící stacionární fázi“. To - podle mě - nechává některé otázky otevřené, např. jaká směs, jaký analyt, co je mobilní fáze, kolona, stacionární fáze?Na úvod se naučme několik základních pojmů:<ul><li>Analyt: Například jídlo a pití nebo jakýkoli druh léku - Směs jednotlivých složek, které je třeba oddělit a jednotlivě změřit.</li><li>Kolona (neboli separační kolona) je klíčový spotřební materiál při chromatografických separacích. LC kolonu lze popsat jako trubku - většinou vyrobenou z nerezové oceli, která drží „stacionární fázi“ mezi dvěma kovovými fritami a koncovkami, které umožňují instalaci v systému HPLC.</li><li>Mobilní fáze: Mobilní fáze v HPLC je kapalina, která přenáší analyt přes separační kolonu.</li><li>Stacionární fáze: Chemická vazba na malé částice, které vyplňují tělo kolony. Stacionární fáze je místem, kde dochází k separaci na základě rozdílných tendencí sloučenin k interakci s ní, což vede k rozdílné rychlosti pohybu kolonou a způsobuje separaci látek.</li></ul><figure class="image"><img style="aspect-ratio:606/107;" src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Getting_started_Figure_1_Typical_set_up_of_HPLC_instrumentation_84c8fdb370.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Začínáme - Obrázek 1 Typické uspořádání HPLC instrumentace" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Getting_started_Figure_1_Typical_set_up_of_HPLC_instrumentation_84c8fdb370.jpg 245w," sizes="100vw" width="606" height="107"></figure>Jakmile se analyt nesený mobilní fází oddělí v koloně se stacionární fází, vhodný detektor rozpozná analyt vystupující z kolony a vytvoří signálový pík v grafu zvaném chromatogram.Typické schéma systému HPLC a jeho jednotlivých složek je vidět na obrázku 1, zatímco obrázek 2 znázorňuje proces separace na koloně naplněné stacionární fází.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Getting_started_Figure_2_Schematic_representation_of_a_liquid_chromatographic_separation_of_two_compounds_f817ccdf48.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Začínáme - Obrázek 2 Schematické znázornění separace dvou sloučenin pomocí kapalinové chromatografie" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Getting_started_Figure_2_Schematic_representation_of_a_liquid_chromatographic_separation_of_two_compounds_f817ccdf48.jpg 245w," sizes="100vw" width="1488" height="943">Jako příklad aplikace kapalinové chromatografie uveďme <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=beverages">nápoje</a>. Nápoje (např. voda, džus, nealkoholický nápoj, káva, pivo, víno) obsahují vodu, cukr, vitamíny, kofein, alkohol a další složky - žádoucí i nežádoucí. Ty nežádoucí se nazývají kontaminanty, které mohou být škodlivé.Jednou z nejčastějších aplikací HPLC je zajištění kvality výrobků - tedy bezpečnosti spotřebitelů. Aby bylo možné určit přesné množství každé jednotlivé složky - ať už jde o vitamin, cukr nebo pesticid - je třeba je od sebe oddělit a po oddělení HPLC usnadňuje identifikaci a kvantifikaci každé jednotlivé složky, aby bylo zajištěno správné složení složek, nepřítomnost nežádoucí kontaminace a kvalita výrobku.Chceme vědět, co v něm je, a v ideálním případě také, kolik toho je přítomno. Cílem je separace a termínem pro měření separace v chromatografii je rozlišení. Rozlišení je důležité a bude tématem dalšího článku.&nbsp;<blockquote><h5>Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu</h5><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2299">Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/4568">Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/547">Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2495">MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/3378">Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE &amp; Material Testing | Environmental Monitoring</a></li></ul></blockquote><h4>Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=basics+fundumentals">v knihovně LabRulezLCMS</a></h4><ul><li>Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)</li><li>Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace)&nbsp;</li><li>Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)</li><li>SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)</li><li>Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)</li></ul>

Shimadzu HPLC Blog: Začínáme

Dnes si povíme něco o rozlišení (R). Přesná identifikace a kvantifikace jednotlivých sloučenin je možná pouze tehdy, když příslušné píky v chromatogramu vystupují z kolony s určitým odstupem. Tento prostor mezi píky se nazývá rozlišení. Cílem chromatografické separace je odpovídající rozlišení složek, které nás zajímají, v přiměřeném časovém rámci.Rs lze vypočítat s přihlédnutím k rozdílům v retenci a šířce elučních píků. Čím větší je rozdíl v retenčním čase (tR) a čím menší je šířka píku, tím širší je rozlišení. Tenké píky budou obecně lépe rozlišeny od sousedních píků než široké pásy, jak je znázorněno na obrázku 1.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Zakladni_teorie_Obrazek_1_Znazorneni_vlivu_retence_a_sirky_piku_na_rozliseni_e4a240b0d1.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 1 Znázornění vlivu retence a šířky píku na rozlišení" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Zakladni_teorie_Obrazek_1_Znazorneni_vlivu_retence_a_sirky_piku_na_rozliseni_e4a240b0d1.jpg 245w," sizes="100vw" width="2698" height="1409">Než však budeme pokračovat, je dobré seznámit se s několika základními pojmy, se kterými se budeme setkávat i později:<ul><li>Základní linie: Čára, která je vidět na chromatogramu, když není detekována žádná sloučenina - základní linie odráží nulový signál.</li><li>Separace na základní linii: Graf se vrací k nule, dotýká se základní linie, než vystoupá k dalšímu maximu píku.</li><li>Chromatogram: Vizuální výstup separačního systému - různé píky na chromatogramu odpovídají různým složkám separované směsi (obrázek 2).</li><li>Eluce: proces migrace sloučeniny přes kolonu nesenou mobilní fází.</li><li>Retenční čas (tR): Doba, za kterou určitý analyt projde systémem za stanovených podmínek. Nazývá se retenční, protože stacionární fáze sloučeninu zadržuje.</li><li>Rozlišení (Rs): Měřítko separace dvou píků v chromatogramu - na základě rozdílů v retenci a šířce píku.</li></ul>Existují různé způsoby výpočtu rozlišení - žádným z nich se zatím nebudeme zabývat. O způsobu dosažení rozlišení a vzorcích pro jeho výpočet budeme hovořit, až se dostaneme k vývoji a optimalizaci metody. Jedním ze základních požadavků na cestě k separaci je však to, aby sloučeniny, které nás zajímají, vykazovaly retenci na stacionární fázi. Pokud analyt neinteraguje se stacionární fází kolony, pak celý vzorek projde kolonou a všechny jeho složky dopadnou na detektor současně, tudíž nedojde k separaci. Prvním důležitým krokem je tedy nastavení systému, ve kterém se budou sloučeniny na koloně zadržovat. Existují různé mechanismy, které nabízejí retenci pro různé vzorky, které představíme jako další téma. Dnes se ještě jednou podíváme na chromatogram, protože je důležité pochopit vizuální výstup - výsledek naší LC separace.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Zakladni_teorie_Obrazek_2_Ukazka_HPLC_chromatogramu_68911ed8d4.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 2 Ukázka HPLC chromatogramu" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Zakladni_teorie_Obrazek_2_Ukazka_HPLC_chromatogramu_68911ed8d4.jpg 245w," sizes="100vw" width="4103" height="2475">Chromatogram je dvourozměrný graf, kde osa Y představuje intenzitu signálu detektoru a osa X čas analýzy. Odezva detektoru se vztahuje ke koncentraci cílové sloučeniny v elučním píku.tR - neboli retenční čas - označuje časový interval mezi nadávkováním vzorku a vrcholem jeho píku. Na druhé straně doba, kterou potřebuje nezadržená látka k cestě přes kolonu k detektoru, se nazývá mrtvý čas a vyjadřuje se jako t0. Pouze pokud je tR větší než t0, znamená to, že pík vykazuje známky interakce se stacionární fází. Pokud sloučeniny eluují při t0, je třeba separační systém upravit tak, aby se zvýšila retence. Obecně platí, že za stejných podmínek bude analyt vždy vykazovat stejný retenční čas, a proto lze tR použít k identifikaci píku.Podívejme se na příklad (obrázek 3): Standardní roztok kofeinu je analyzován pomocí HPLC, výsledkem je jeden pík sloučeniny v čase pět minut. V následném experimentu je stejným způsobem analyzován zředěný vzorek čaje, jehož výsledkem je chromatogram s několika píky. Mezi těmito signály je jeden eluující v retenčním čase přibližně 5 min, stejném jako u standardu kofeinu. Tento pík lze považovat za kofein, identifikovaný na základě LC retence. Dále lze plochu pod křivkou píku použít k výpočtu koncentrace cílové sloučeniny.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Gesa_Schad_Product_Manager_at_Shimadzu_Europa_Gmb_H_My_LC_Blog_Zakladni_teorie_b357bf75f0.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie - Obrázek 3 Srovnání chromatogramu standardu kofeinu a vzorku zředěného čaje s vyznačeným píkem kofeinu" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Gesa_Schad_Product_Manager_at_Shimadzu_Europa_Gmb_H_My_LC_Blog_Zakladni_teorie_b357bf75f0.jpg 245w," sizes="100vw" width="2079" height="1107">V dalším díle našeho Shimadzu HPLC blogu se můžete těšit na příklady různých separačních režimů v HPLC.<blockquote><h5>Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu</h5><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2299">Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/4568">Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/547">Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2495">MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/3378">Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE &amp; Material Testing | Environmental Monitoring</a></li></ul></blockquote><h4>Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=basics+fundumentals">v knihovně LabRulezLCMS</a></h4><ul><li>Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)</li><li>Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace)&nbsp;</li><li>Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)</li><li>SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)</li><li>Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)</li></ul>

Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie

Navážeme na minulý díl (Shimadzu HPLC Blog: Základní teorie) a probereme, jak dosáhnout retence cílových sloučenin ve stacionární fázi. Rozhodujícími parametry, které je třeba zvážit, jsou kombinace mobilní fáze a stacionární fáze. Sloučeniny, které se raději zdržují v mobilní fázi, budou kolonou postupovat rychleji než ty, které budou pravděpodobně silně interagovat se stacionární fází. Pouze sloučeniny, které vykazují určitou přitažlivost ke zvolené separační koloně, v ní budou zadrženy.&nbsp;Pro začátek je třeba mít představu o chemických vlastnostech daného vzorku a podle toho zvolit vhodný separační systém. Různá uspořádání LC systému jsou znázorněny v tabulce 1.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Tabulka_1_Zakladni_separacni_mody_v_HPLC_5b539aef78.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Tabulka 1 Základní separační módy v HPLC" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Tabulka_1_Zakladni_separacni_mody_v_HPLC_5b539aef78.jpg 245w," sizes="100vw" width="1600" height="648">V praxi se naprostá většina aplikací HPLC provádí v režimu reverzní fáze s použitím kolony C18 - což bude podrobněji vysvětleno v dalším článku - ale i ostatní jsou neméně důležité a neměly by zůstat nezmíněny. Pro lepší pochopení budou v následujícím textu vysvětleny některé pojmy podrobněji.<h3>Chromatografie na Normální fázi</h3><ul><li>Literatura Shimadzu zaměřená na <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=27&amp;mainauthorItems=1">HPLC v knihovně LabRulezLCMS</a></li></ul>V režimu kapalinové chromatografie "na normální fázi" se používá polární stacionární fáze a mobilní fáze s nízkou polaritou pro separaci nízko až středně polárních sloučenin, které se snadno rozpouštějí v organických rozpouštědlech (tj. vzorků, které jsou nerozpustné ve vodných roztocích). Separace je založena na rozdílech v polaritě, zatímco pro analýzu sloučenin s malými rozdíly v hydrofobicitě je nevhodná. Typickými stacionárními fázemi používanými v LC na normální fázi jsou např. oxid křemičitý nebo fáze s malými polárními funkčními skupinami, jako jsou amino, diol nebo kyano vázané na povrch oxidu křemičitého. Mobilními fázemi jsou nepolární rozpouštědla, např. n-hexan nebo ethylacetát. Grafické znázornění retenčního chování v LC na normální fázi je znázorněno níže.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Obrazek_1_Retence_analytu_v_chromatografii_na_normalni_fazi_02aaf230ae.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 1 Retence analytu v chromatografii na normální fázi" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Obrazek_1_Retence_analytu_v_chromatografii_na_normalni_fazi_02aaf230ae.jpg 245w," sizes="100vw" width="1600" height="725"><ul><li>Polarita: Fyzikální vlastnost sloučeniny, která určuje stupeň interakce s mobilní a stacionární fází při separaci na normální a reverzní fázi HPLC.</li><li>Polární sloučenina: nebo-li „hydrofilní“, což v překladu znamená „s afinitou k vodě“ nebo „milující vodu“. Zjednodušeně řečeno - polární sloučenina se rozpouští ve vodě a silně interaguje s polární stacionární fází.</li><li>Nepolární sloučenina: nebo-li „hydrofobní“ je jinými slovy „odpuzující vodu“ nebo „nesnášející vodu“, jako například olej. Nepolární sloučeniny se ve vodě nerozpouštějí a přilnou k nepolárním stacionárním fázím.</li></ul><h3>Iontová chromatografie (IC)</h3><ul><li>Literatura Shimadzu zaměřená na <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=28&amp;mainauthorItems=1">Iontovou chromatografii v knihovně LabRulezLCMS</a></li></ul>Jinými slovy „iontově výměnná chromatografie“ (IEC) je určena ke stanovení látek nesoucích náboj, ať už anorganických nebo organických iontů. Příkladem mohou být peptidy, proteiny, organické kyseliny nebo protonované báze. Iontově výměnná stacionární fáze se skládá z iontových skupin, které jsou vázány na nosič, zatímco mobilní fází je obvykle vodný pufrový systém s upraveným pH. Retence je řízena pH a iontovou silou mobilní fáze. K separaci dochází prostřednictvím výměnných rovnováh mezi analyty v roztoku a ionty eluentu, které interagují s nabitým povrchem stacionární fáze. Obrázek 2 ukazuje schéma tohoto mechanismu pro aniontové (záporně nabité) sloučeniny. Vyšší koncentrace iontů v mobilní fázi má za následek rychlejší eluci rozpuštěného iontu prostřednictvím konkurence.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Separacni_mody_Obrazek_2_Retencni_mechanismus_v_iontove_chromatografii_364dbf919f.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 2 Retenční mechanismus v iontové chromatografii" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Separacni_mody_Obrazek_2_Retencni_mechanismus_v_iontove_chromatografii_364dbf919f.jpg 245w," sizes="100vw" width="1600" height="428"><ul><li>pH: míra kyselosti nebo zásaditosti vodného roztoku. Stupnice se pohybuje od 1 (kyselý) do 14 (zásaditý). Změny pH ovlivňují chromatografickou retenci.</li><li>Pufr: Roztoky pufru - tedy vodné roztoky slabé kyseliny a její soli (např. kyselina mravenčí + mravenčanový iont) jsou běžně používané mobilní fáze, protože mohou odolávat změnám pH při přidání malého množství kyselin nebo zásad, což vede ke stabilním LC podmínkám.</li><li>Iontová síla: Koncentrace iontů v roztoku, přičemž ion znamená kladně nebo záporně nabitý atom nebo molekulu.</li></ul><h3>Vylučovací chromatografie (SEC)</h3><ul><li>Literatura Shimadzu zaměřená na <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=42&amp;mainauthorItems=1">GPC/SEC v knihovně LabRulezLCMS</a></li></ul>SEC se používá pro vzorky, které obsahují vysokomolekulární sloučeniny a jejichž složky se výrazně liší molekulovou velikostí. Lze ji například použít k separaci proteinů s různou velikostí, přičemž jako mobilní fáze se používají vodné pufry s téměř neutrálním pH, aby se zachovala biologická aktivita proteinů. Další typickou aplikací je stanovení distribuce molekulových hmotností polymerů, kde se typicky jedná o tzv. gelovou permeační chromatografii (GPC) - zde se jako eluent používají organická rozpouštědla při zvýšené teplotě, aby se polymery rozpustily. Retence je určena především velikostí pórů stacionární fáze, nikoliv vlastnostmi mobilní fáze. Molekuly malých rozměrů vstupují hluboko do pórů, což způsobuje, že se po koloně pohybují mnohem pomaleji než molekuly větších rozměrů, které se do pórů nevejdou (nebo jen částečně). Výsledkem je pořadí eluce z kolony podle velikosti, přičemž velké sloučeniny &nbsp;vycházejí z kolony jako první, zatímco malé molekuly jsou zadržovány déle. Vizualizace tohoto principu je na obrázku 3.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Obrazek_3_Princip_separace_ve_vylucovaci_chromatografii_df8c2d56b1.jpg" alt="Shimadzu/Gesa Schad: Shimadzu HPLC Blog: Separační módy - Obrázek 3 Princip separace ve vylučovací chromatografii" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Shimadzu_Gesa_Schad_Shimadzu_HPLC_Blog_Separacni_mody_Obrazek_3_Princip_separace_ve_vylucovaci_chromatografii_df8c2d56b1.jpg 245w," sizes="100vw" width="1369" height="426">Vzhledem k tomu, že chromatografie na reverzní fázi se používá v naprosté většině aplikací HPLC, bude jí věnován další příspěvek na blogu.<blockquote><h5>Edukativní HPLC a LC/MS webinaře Shimadzu</h5><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2299">Introducing Shimadzu's Analytical Intelligence in AQbD Method Development</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/4568">Chromatography Unleashed: Elevate Your Chiral and Achiral Separations</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/547">Shimadzu's LC Method Development (RP) Series - Session 1: Method Screening</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/2495">MALDI-Imaging For All: A Researcher’s Guide</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.labrulez.com/webinar/3378">Analytical Technologies for COVID-19 Challenges: Drug Repurposing | Vaccine Research | PPE &amp; Material Testing | Environmental Monitoring</a></li></ul></blockquote><h4>Výběr literatury Shimadzu se zaměřením na základy a principy HPLC a LC/MS <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=basics+fundumentals">v knihovně LabRulezLCMS</a></h4><ul><li>Back to Basics - Explaining Resolution (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Gradient Retention Factor, K* (Technické články | 2020)</li><li>Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>RF-20A Fluorescence Detector Basics and Applications (Technické články | 2010)</li><li>Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>The Very Basics of IMAGEREVEAL MS - With differential analysis as an example (Prezentace)&nbsp;</li><li>Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments (Technické články | 2020)</li><li>Improving the Yield of Basic Amino Acids in a Protein Sequencer (Aplikace | 2023)</li><li>SFC Basic Guide - Shimadzu Supercritical Fluid Chromatograph (Příručky | 2021)</li><li>Rewriting the Book on Supercritical Fluid Chromatography (Technické články | 2024)</li></ul>

Shimadzu HPLC Blog: Separační módy

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Naším posláním je šířit informace o produktech firmy Shimadzu v oblasti instrumentálních analytických přístrojů, přístrojů pro testování materiálů a speciálních přístrojů pro life science, jejich prodej a následně - instalace, zaškolení, záruční a pozáruční servis, ověřování a validace a aplikační podpora.

SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka

2026 Prague Metabolism and Signaling Symposium

Pragolab DISCOVERY DAYS 2026 v Praze a Brně

Advances in Chromatography and Electrophoresis & Chiranal 2026

Enabling Robust HILIC LC–MS Workflows for Highly Polar Compound Analysis

Charge! Next-Generation LNP Assays with Waters Reversed Phase Charge Aerosol Detection

Development and Implementation of an Efficient LC-TOF MS Screening Workflow in Seized Drug Analysis

LCMS novinky typu akademie - strana 1