<h3>Úvod do HPLC</h3>
Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) je proces separace složek v kapalné směsi. Kapalný vzorek se vstřikuje do proudu rozpouštědla (mobilní fáze) proudícího přes kolonu naplněnou separačním médiem (stacionární fází). Komponenty vzorku se od sebe oddělují procesem diferenciální migrace, jak procházejí kolonou.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Separace_jednotlivych_komponent_nesenych_mobilni_fazi_na_chromatograficke_kolone_81e637de63/Shimadzu-Separace-jednotlivych-komponent-nesenych-mobilni-fazi-na-chromatograficke-kolone.jpg" alt="Shimadzu: Separace jednotlivých komponent nesených mobilní fází na chromatografické koloně"/>
Jak se pásy (komponenty) postupně eluují z kolony, tok je přenáší k jednomu nebo více detektorům, které dodávají napěťovou odezvu jako funkci času. Tomu se říká chromatogram. Identifikace složky vzorku značí čas píku, kdy se objeví v chromatogramu s ohledem na standard. Plocha píku představuje množství.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Jednotlive_separovane_slozky_vs_chromatograficky_zaznam_5bfa91ed41/Shimadzu-Jednotlive-separovane-slozky-vs.-chromatograficky-zaznam.png" alt="Shimadzu: Jednotlivé separované složky vs. chromatografický záznam"/>
<h3>Základní komponenty HPLC</h3>
<ul>
<li>Vakuový odplyňovač (Degassér) – odstraňuje vzduchové plyny z rozpouštědla (mobilní fáze) při jeho proudění do HPLC čerpadla.
</li>
<li>HPLC pumpa – zajišťuje stálý průtok rozpouštědla nebo případně také dávkování vzorku.
</li>
<li>Autosampler – nabírá vzorky z vialek a vstřikuje je do toku rozpouštědla poskytovaného pumpu.
</li>
<li>Detektor – reaguje na separované analyty vycházející z HPLC kolony a poskytuje výstupní signál/odezvu pro software.
</li>
<li>Kolonový termostat – je místem pro umístění HPLC kolony a udržuje stabilní teplotu pro reprodukovatelnou separaci.
</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Zakladni_komponenty_HPLC_UHPLC_systemu_3c36532618/Shimadzu-Zakladni-komponenty-HPLC-UHPLC-systemu.png" alt="Shimadzu: Základní komponenty HPLC - UHPLC systému"/>
<h3>Izokratické vs. gradientové režimy</h3>
<h5>Izokratická eluce</h5>
<ul>
<li>Po dobu separace se používá jedno konstantní složení rozpouštědel</li>
<li>Později eluující píky jsou širší než dříve eluující píky kvůli disperzi</li>
<li>Je nezbytné pravidelně proplachovat kolonu rozpouštědlem o vyšší síle, aby se vyčistila od nepoddajných složek, které se v koloně hromadí po nástřiku vzorku</li>
</ul>
<h5>Gradientová eluce</h5>
<ul>
<li>Složení rozpouštědel se mění kontinuálně nebo krokově</li>
<li>Obecně jsou píky na celém chromatogramu ostřejší ve srovnání s izokratickou elucí</li>
<li>Mohou být dosaženy určité separace, které nelze dosáhnout pomocí izokratické eluce</li>
<li>Doba analýzy může být kratší ve srovnání s izokratickou elucí</li>
</ul>
<h3>Izokratické a gradientové režimy pump</h3>
<h5>Izokratické čerpadlo</h5>
Jednokanálové čerpadlo, které vyžaduje, aby uživatel předem připavil a promíchal mobilní fázi. Složení zůstává konstantní s časem.
<h5>Kvartérní nízkotlaké gradientové čerpadlo</h5>
Čtyřkanálové čerpadlo, které pod softwarovou kontrolou vytváří směs rozpouštědla až ze 4 složek. Míchání se provádí před hlavami čerpadel v nízkotlaké části systému. Složení rozpouštědla se může časem měnit
<h5>Binární vysokotlaké gradientové čerpadlo</h5>
Dvoukanálové čerpadlo, které pod kontrolou vytváří směs ze 2 rozpouštědel. Míchání se provádí za hlavami ve vysokotlaké části systému. Složení se může časem měnit.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Lab_Solutions_program_pumy_Screening_Gradient_0c351351a3/Shimadzu-LabSolutions-program-pumy-Screening-Gradient.png" alt="Shimadzu: LabSolutions program pumy – Screening Gradient"/>
<h3>Screening Gradient – výkonný pro vývoj metod</h3>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Screening_Gradient_e5669cd9ee/Shimadzu-Screening-Gradient.png" alt="Shimadzu: Screening Gradient"/>
Interpretace: U LC kolony s reverzní fází, kde složka A je voda a B organická fáze, tento první run ukazuje složky vzorku, které jsou všechny polární. Separace je tedy špatná, protože látky se ve stacionární fázi málo dělí. Jinými slovy, slabý výchozí stav rozpouštědla eluuje vzorky příliš brzy.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Prubeh_HPLC_gradientu_cf9873f226/Shimadzu-Prubeh-HPLC-gradientu.png" alt="Shimadzu - Průběh HPLC gradientu.png"/>
Aby se látky více rozdělovaly do stacionární fáze, snížime sklon gradientu, čímž se síla mobilní fáze nebude zvyšovat tak rychle. Látky zůstávají delší dobu ve stacionární fázi a začínají se od sebe oddělovat. Všimněte si, že kolonu stále na konci cyklu „propláchneme“ silným rozpouštědlem, abychom kolonu účinně vyčistili.
Dále snižujeme sklon gradientu, dokud v časovém rámci nevidíme dobrou separaci látek.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_snizovani_sklonu_HPLC_gradientu_a121200bf8/Shimadzu-snizovani-sklonu-HPLC-gradientu.png" alt="Shimadzu: Snižování sklonu HPLC gradientu"/>
Ve druhé části série o základech a principech v HPLC /UPLC se podíváme na nejběžnější detektory a teorii k HPLC kolonám.
Další detailnější informace k základům v kapalinové chromatografie můžete najít ve více než 20-ti Shimadzu publikacích v <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=fundamental&amp;instrumentationItems=27">Knihovně</a> nebo v sérii 5-ti komplexních Shimadzu <a href="https://lcms.cz/webinars?companyId=43">Webinářů - LC Teorie a Klíčové principy</a> dostupných ze záznamu.

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT

O základním stavebním prvku u kapalinových chromatografů a tedy chromatografické pumpě a gradientech které poskytuje, jsme Vám psali v předchozím příspěvku <a href="https://lcms.cz/article/1026">Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - PUMPY A GRADIENT</a>.
Jak se pásy (komponenty) postupně eluují z kolony, tok je přenáší k jednomu nebo více detektorům, které dodávají napěťovou odezvu jako funkci času. Tomu se říká chromatogram. Identifikace složky vzorku značí čas píku, kdy se objeví v chromatogramu s ohledem na standard. Plocha píku představuje množství.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Shimadzu_Jednotlive_separovane_slozky_vs_chromatograficky_zaznam_5bfa91ed41/Shimadzu-Jednotlive-separovane-slozky-vs.-chromatograficky-zaznam.png" alt="Shimadzu: Jednotlivé separované složky vs. chromatografický záznam"/>
V dnešním příspěvku se podívámé na přehled základních chromatografických detektorů a tedy ve vetšině případu konce celého separačního procesu, který nám umožní různé typy látek kvalitativně a kvantitativně stanovit na různých koncetračních hladinách.
<h3>UV/Vis detektor</h3>
<ul>
<li>Reaguje na chromoforické analyty v rozmezí 190 – 800 nm</li>
<li>Kontinuální monitorování jedné nebo více vybraných vlnových délek</li>
<li>Možnost analýzy většiny organických analytů</li>
<li>Kompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=vis&amp;instrumentationItems=27&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4">Aplikace, postery, příručky a technické články pro UV/Vis detektor.</a>
<h3>Detektor fotodiodového pole (PDA)</h3>
<ul>
<li>Reaguje na chromoforické analyty v rozmezí 190 – 800 nm</li>
<li>Kontinuální monitorování více vlnových délek i celého rozsahu najdnou</li>
<li>Kompletní spektrální profily chromatografických píků</li>
<li>Kompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=PDA&amp;instrumentationItems=27&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4">Aplikace, postery, příručky a technické články pro PDA detektor.</a>
<h3>Fluorescenční detektor (FLD)</h3>
<ul>
<li>Analyzuje pouze analyty, které fluoreskují přirozeně a nebo je zle derivatizovat fluoreskujícím činidlem</li>
<li>Vysoce citlivostní a selektivní detekce</li>
<li>Kompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=Fluorescence&amp;instrumentationItems=27&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4">Aplikace, postery, příručky a technické články pro fluorescenční detektor.</a>
<h3>Detektor indexu lomu (RID)</h3>
<ul>
<li>Považován za univerzální detektor pro všechny analyty</li>
<li>Nejméně citlivý detektor</li>
<li>Nekompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=refractive&amp;instrumentationItems=27&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4">Aplikace, postery, příručky a technické články pro detektor indexu lomu.</a>
<h3>Detektor rozptylu světla (ELSD)</h3>
<ul>
<li>Považován za téměř univerzální detektor reagující na chromoforické i nechromoforické analyty</li>
<li>Dobrá citlivost</li>
<li>Kompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;search=ELSD&amp;instrumentationItems=27&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4">Aplikace, postery, příručky a technické články pro ELSD detektor.</a>
<h3>Hmotnostní spektrometrické detektory (MS)</h3>
<ul>
<li>Nejvyšší specificita analýzy</li>
<li>Poskytuje informace o dané hmotě pro identifikaci analytu a objasnění struktury</li>
<li>Vysoce citlivy</li>
<li>Kompatibilní s elucí gradientem</li>
</ul>
<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=1&amp;publicationTypeItems=1-2-5-4&amp;instrumentationItems=31">Aplikace, postery, příručky a technické články pro LC/MS detektory.</a>
<h3>UV/Vis vs. PDA detektor pro (U)HPLC</h3>
Systémy kapalinové chromatografie obsahují detektory vybrané podle chemie cílových analyzovaných látek. Drtivá většina detektorů pro (U)HPLC jsou detektory absorbující světlo v ultrafialové (UV) a viditelné (Vis) oblasti spektra rozsahu vlnových délek 190 – 900 nanometrů (nm) a často se označují jako UV/Vis nebo UV-Vis. 
Většina analýz organických analytů je v ultrafialové oblasti 190 – 350 nm. HPLC/UV obecně měří pouze několik uživatelem stanovených a volitelných vlnových délek. Sledované analyty přírodních látek se většinou analyzují při vlnových délkách 220 a 274 nm. Potvrzení konkrétního analytu je tedy založeno na jeho reteční době v chromatografii.
Fotodiodové pole, také známé jako detektor diodového pole, může měřit celý rozsah vlnových délek v reálném čase, což poskytuje další výhody oproti klasickému UV/Vis detektoru. 
Obrázek 1 ukazuje příklad analýzy kanabinoidů spektrálním absorpčním profilem, který lze použít jako druhou formu potvrzení analytu. Všimněte si, že neutrální kanabinoidy (deta-9-THC, delta-8-ZHC, THCV, CBD, CBDV a CBG) v modrých stopách mají podobný spektrální profil, který se liší od uvedenách kyselých forem (THCA, CBDA a CGBA) v červených stopách. Kyselé kanabinoidy mají funkční skupinu karboxylové kyseliny (-COOH), která poskytuje nižší energii a vyšší maxima absorbance vlnového čísla. PDA může být tedy užitečný při rozlišování mezi analyty s odlišnými absorpčními spektry. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_1_Priklad_kanabinoidu_merenych_U_HPLC_s_detekci_PDA_8b0195021c/Obrazek-1-Priklad-kanabinoidu-merenych-(U)HPLC-s-detekci-PDA.jpg" alt="Obrázek 1: Příklad kanabinoidů měřených (U)HPLC s detekcí PDA"/>
V našem příkladu lze PDA použít k rozlišení neutrálních kanabinoidů proti kyselé formy, ale nemělo by se použít k potvrzení kanabioidů ve stejné třídě.
PDA má další výhody v tom, že spektrální profil může pomoci při určování neznámého píku. Pro úplné potvrzení analýzy by ale měla být prováděna detekce pomocí hmotnostní spektrometrie. 
Ve farmaceutickém průmyslu se PDA často používá ke stanovení maximální čistoty cílové sloučeniny. Spektra absorbance jsou porovnávána ve více bodech napříč píkem pro podobnost a rozdíly ukázané na obrázku 2. Software sám automaticky indikuje, zda nedošlo ke co-eluci více látek v jednom píku, pomocí indexu čistoty píku.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_2_Zjednodusene_schema_mereni_cistoty_latek_napric_chromatografickym_pikem_ve_srovnani_se_spektralni_absorbanci_7a0fb16d7e/Obrazek-2-Zjednodusene-schema-mereni-cistoty-latek-napric-chromatografickym-pikem-ve-srovnani-se-spektralni-absorbanci.jpg" alt="Obrázek 2: Zjednodušené schéma měření čistoty látek napříč chromatografickým píkem ve srovnání se spektrální absorbancí"/>
<h3>Nové funkce i-PDeA</h3>
Shimadzu nabízí výkonné rozšíření spektrálních schopností detekce diodového pole. Funkce i-PDeA poskytuje dekonvoluci píků (virtuální oddělení chromatograficky nevyřešených píků). Vzhledem k tomu, že detektor PDA shromažďuje jak časové informace (chromatogram), tak i spektrální informace (UV spektrum), obrázek 3, je možné dekonvoluovat data a určit množství každého analytu v co-eluujícím píku. 
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Obrazek_3_Dekonvoluce_i_P_De_A_koeluujicich_piku_s_vyuzitim_casove_informace_chromatogramu_i_spektralni_informace_UV_spektrum_ef9f2d3277/Obrazek-3-Dekonvoluce-i-PDeA-koeluujicich-piku-s-vyuzitim-casove-informace-(chromatogramu)-i-spektralni-informace-(UV-spektrum).jpg" alt="Obrázek 3: Dekonvoluce i-PDeA koeluujících píků s využitím časové informace (chromatogramu) i spektrální informace (UV spektrum)"/>
Tato technika se snadno používá a má velkou schopnost vytvářet kvantitativní výsledky z virtuálné separovaných píků. Dekonvoluce i-PDeA se opírá o spolehlivé vědecké principy, nikoli o odhad založený na gaussovském modelování, které se používalo v minulosti.

Základy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) - DETEKTORY

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Naším posláním je šířit informace o produktech firmy Shimadzu v oblasti instrumentálních analytických přístrojů, přístrojů pro testování materiálů a speciálních přístrojů pro life science, jejich prodej a následně - instalace, zaškolení, záruční a pozáruční servis, ověřování a validace a aplikační podpora.

SHIMADZU Handels GmbH - organizační složka

Moderní elektroanalytické metody (Cena Metrohm 2026)

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Praktický kurz ŠKOLA HPLC

Big Scale, Big Wins: Prep Chromatography Explained

High-throughput stability screening strategies for antibody formulation

PFAS in Food & Food Contact Material