Přestaňte používat C18 pro polární analyty
- Foto: Phenomenex: Přestaňte používat C18 pro polární analyty
- Video: Phenomenex: HILIC Explained in 1 minute
C18 fáze neposkytují dostatečnou retenci polárních sloučenin. Výsledkem je často koeluce a potlačení signálu v LC–MS. Při analýze polárních analytů proto C18 obvykle není vhodnou volbou.
HILIC (hydrofilní interakční chromatografie) představuje odlišný separační přístup.
Princip HILIC
Počáteční složení mobilní fáze je 90 % acetonitrilu a 10 % amonného pufru. Vysoký podíl organické složky vytváří na polární stacionární fázi tenkou vodou obohacenou vrstvu. Analyty se do této vrstvy rozdělují a se zvyšujícím se obsahem vody v mobilní fázi dochází k jejich eluci.
Základní body vývoje metody
1. Volba stacionární fáze
Zvolte vhodnou polární stacionární fázi, například:
- silika
- diol
- aminová fáze
- zwitteriontová fáze
2. Počáteční podmínky složení mobilní fáze
- Začněte na 90 % acetonitrilu s amonným pufrem.
- Nepoužívejte methanol — narušuje vodou obohacenou vrstvu a tím ovlivňuje retenci.
3. Gradient
V HILIC je voda silné eluční činidlo. Gradient tedy začíná vysokým podílem organické složky a následně se postupně zvyšuje podíl vody.
4. Optimalizace pH
Porovnejte:
- pH 3,2 (mravenčan amonný)
- pH 5,8 (octan amonný)
A vyhodnoťte rozdíly.
5. Ekvilibrace
Zajistěte dostatečnou ekvilibraci systému.
Praktické upozornění
Nadměrný obsah vody ve vzorku narušuje retenci v HILIC a vede ke zhoršenému tvaru píků.
