Proč odstraňovat fosfolipidy ze vzorku?

Při analýze látek ze séra nebo plazmy je velmi pravděpodobné, že vzorky budou obsahovat fosfolipidy, které jsou hlavní složkou membrán savčích buněk. Tyto fosfolipidy vykazují širokou škálu struktur a polarit; jejich hydrofobnější frakce má tendenci se při opakovaných nástřicích postupně usazovat na HPLC koloně s reverzní fází (např. C18). Tento proces vede k postupnému nárůstu zpětného tlaku, který je obvykle doprovázen poklesem separační účinnosti. Může rovněž docházet ke změnám selektivity.

Pokud je použita UV detekce, může problém skončit právě zde. Jsou-li vzorky připraveny pouze proteinovou precipitací, která je rychlá a levná, je kratší životnost kolony často akceptována jako nevyhnutelný důsledek nízké úrovně předúpravy vzorku. Při použití MS detekce však může docházet k iontové supresi nebo iontovému zesílení. Tyto jevy jsou obecně přisuzovány koeluci fosfolipidů s analyty zájmu. Přítomnost fosfolipidů ve zdroji MS může v daném okamžiku ovlivnit účinnost ionizace.

Phenomenex: Proč odstraňovat fosfolipidy ze vzorku? Obrázek 1: Hodnocení citlivosti kolony po opakovaných nástřicích diklofenaku v plazmě připravené proteinovou precipitací ve srovnání se vzorky připravenými pomocí produktu pro přípravu vzorků.

V důsledku toho může být spolehlivost získaných dat ovlivněna přítomností fosfolipidů, protože množství analytu může být podhodnoceno (vlivem iontové suprese) nebo nadhodnoceno (v důsledku iontového zesílení). Zda tento problém ve vaší separaci nastává, lze ověřit následujícím experimentem:

• Pomocí dávkovací stříkačky můžete přímo dávkovat roztok analyzované látky.
• Současně připravte slepý vzorek séra/plazmy obvyklým postupem přípravy vzorku. Tento slepý vzorek nadávkujte a spusťte běžnou HPLC metodu.
• Sledujte iontový proud pro MS/MS přechody analytu zájmu.

Phenomenex: Proč odstraňovat fosfolipidy ze vzorku? Obrázek 2: Oblasti iontové suprese při použití proteinem precipitované plazmy oproti plazmě extrahované pomocí produktu pro přípravu vzorků.

V rámci získaného chromatogramu lze identifikovat oblasti iontové suprese nebo iontového zesílení. Pokud analyt zájmu eluuje v některé z těchto zón, existuje riziko problémů s integritou dat.

Nejjednodušším řešením je použití produktu pro přípravu vzorků, který umožňuje současnou precipitaci plazmatických proteinů a odstranění fosfolipidů ze vzniklého supernatantu. Tyto produkty jsou dostupné ve formě zkumavek nebo 96jamkových destiček a obsahují membrány pro odstranění precipitovaných proteinů a sorbent pro záchyt fosfolipidů. Vzorky se smísí s precipitačním činidlem, například methanolem nebo acetonitrilem, a poté se protáhnou přes filtrační destičku a lože sorbentu. Výsledné vzorky jsou zbaveny jak proteinů, tak fosfolipidů, což umožňuje spolehlivou kvantifikaci a prodlužuje životnost kolony.

Phenomenex: Proč odstraňovat fosfolipidy ze vzorku? Obrázek 3: Odstranění fosfolipidů pomocí Phree.