Optimalizace volby iontově párovacího činidla pro analýzu oligonukleotidů metodou HPLC

Klinický potenciál oligonukleotidů jako nástroje pro regulaci genové exprese z nich činí oblast rostoucího zájmu při vývoji nových léčiv. Oligonukleotidy se však od běžných nízkomolekulárních léčiv výrazně liší svými chemickými vlastnostmi, což z nich sice dělá zajímavý analytický cíl, ale zároveň komplikuje jejich analýzu. Jedná se o vysoce polární sloučeniny, které vyžadují specifické podmínky pro úplnou charakterizaci analytů i jejich nečistot.

V této dvoudílné sérii se zaměříme na výzvy, s nimiž se analytici při analýze oligonukleotidů potýkají, a na možnosti optimalizace metod, které mohou využít při vývoji svých analytických postupů.

Phenomenex: Oligonukleotidy

Tradiční přístupy k analýze oligonukleotidů

Tradiční metody analýzy oligonukleotidů často využívají iontově párovací činidla – typicky alkylaminy, jako je triethylamin (TEA) – pro zajištění retence analytů na C18 kolonách. Tyto fáze jsou stále preferovány, protože poskytují vysokou účinnost a výborné rozlišení blízce eluujících nečistot.

V první části této série se zaměříme na vliv mobilní fáze, konkrétně na volbu iontově párovacího činidla, a její dopad na rozlišení a charakterizaci oligonukleotidů.

Volba iontově párovacího činidla

V odborné literatuře se TEA běžně uvádí jako standardní alkylamin používaný v kombinaci s hexafluoroisopropanolem (HFIP). Výzkumy v laboratoři Bartletta však naznačují, že při vývoji metody je vhodné vyhodnotit různé typy alkylaminů, protože každý z nich ovlivňuje retenci a citlivost odlišně.

Obecná doporučení pro volbu alkylaminu:

• Vyšší koncentrace alkylaminu vede k delší retenční době a současně ke zvýšení ionizační účinnosti (viz Obr. 1).
• Volba typu alkylaminu a jeho koncentrace by měla být součástí experimentálního návrhu metody a pečlivě optimalizována.

Phenomenex: Obrázek 1- Celkový iontový chromatogram

Experimentální podmínky (Obr. 1)

• Kolona: Biozen™ 2.6 µm Oligo (100 × 2,1 mm)
• Mobilní fáze A: 12,5 mM HFIP, hexylamin ve vodě
• Mobilní fáze B: 12,5 mM HFIP, hexylamin v methanolu
• Gradient: 25–75 % B za 14 minut
• Průtok: 0,3 mL/min
• Teplota: 65 °C
• Detekce: TOF-MS
• Vzorek: Nusinersen

Optimalizace koncentrace a typu alkylaminu

Vyšší koncentrace alkylaminu sice zvyšuje retenci a ionizační účinnost, ale může vést i k problémům – například k hromadění činidla v LC systému nebo v rozhraní MS, pokud není zavedeno dostatečné promývání.

Jedním ze způsobů, jak snížit potřebné množství činidla, je použít více hydrofobní alkylamin, např. hexylamin (HA). Ten umožňuje:

• snížit koncentraci iontově párovacího činidla,
• použít vyšší podíl organické složky v mobilní fázi,
• zvýšit ionizační účinnost díky vyšší rozpustnosti analytu (viz Obr. 2 a 3).

Phenomenex: Spektra po dekonvoluci

Phenomenex: Obrázek 2

Experimentální podmínky (Obr. 2–3)

• Kolona: Biozen 2.6 µm Oligo (100 × 2,1 mm)
• Mobilní fáze A: 12,5 mM HFIP, 1 mM TEA nebo 4 mM HA ve vodě
• Mobilní fáze B: 12,5 mM HFIP, 1 mM TEA nebo 4 mM HA v methanolu
• Gradient: 5–75 % B za 14 minut
• Průtok: 0,3 mL/min
• Teplota: 65 °C
• Detekce: TOF-MS
• Vzorek: 2’-MOE Gapmer (200 ng)

Další faktory – rozpustnost činidla

Při výběru iontově párovacího činidla je důležité zvážit i jeho rozpustnost. Například oktylamin může díky nižší rozpustnosti vykazovat silnější párovací efekt, ale zároveň vyžaduje vyšší podíl organického rozpouštědla, což může být nevhodné při analýze krátkých oligonukleotidů s nižší retencí.

Shrnutí

Neexistuje univerzální „nejlepší“ iontově párovací činidlo pro analýzu oligonukleotidů, ale dodržováním několika zásad můžete výrazně zlepšit kvalitu a spolehlivost výsledků:

• Optimalizujte typ i koncentraci alkylaminu.
• Využívejte více hydrofobní činidla, pokud je to vhodné pro daný vzorek.
• Sledujte stabilitu systému a zabraňte akumulaci činidla v LC/MS rozhraní.

Správná volba činidla i podmínek umožní dosáhnout lepšího rozlišení, vyšší citlivosti a spolehlivější identifikace nečistot.

Další zdroje

🎥 Podívejte se na naše webináře na téma:

• Oligonucleotide Analysis in Tissue Sampless
• Advances in Oligonucleotide Sample Preparation and Analysis