Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans- izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie.

Nová UHPLC metoda byla srovnána s metodou HPLC používanou pro tato stanovení ve VÚPS z hlediska rychlosti analýzy, účinnosti separace, spotřeby mobilní fáze a konečně byly porovnány opakovatelnosti obou metod. Výsledky studie potvrdily všechny očekávané výhody UHPLC, metoda je 2,5 krát rychlejší při zachování daného rozlišení a víc jak desetinásobně šetří spotřebu organických rozpouštědel. Kromě ekonomických výhod se tato nová metoda vyznačuje vysokou přesností. Ta byla ověřována pomocí opakovatelnosti UHPLC metody pro obě formy iso-α-hořkých kyselin. Zejména pro trans-iso-hořké kyseliny, které jsou významnými ukazateli stárnutí piva během jeho skladování nebo transportu, byla zjištěna lepší opakovatelnost UHPLC metody oproti HPLC.

1 ÚVOD

Během varního procesu se formují iso-α-kyseliny ve dvou prostorových formách, cis- a trans- v poměru 2:1 ve prospěch stabilnější cis-formy. Vlivem působení faktorů ovlivňujících proces stárnutí ubývá rychleji forma trans-, což se projevuje jednak snížením hořkosti piva, jednak tvorbou senzoricky nežádoucích látek. Proto se moderní technologické postupy, které hledají způsoby zpomalení stárnutí piva, zaměřují právě na možnost zpomalit úbytek iso-α-kyselin (De Cooman et al., 2000).

Vývoji analytických metod pro stanovení cis- a trans- forem iso-α-kyselin je věnována pozornost nejen z hlediska jejich šetrné izolace z piva (SPE extrakce), ale také z hlediska jejich dokonalé separace a dostatečně citlivého stanovení v pivu metodami kapalinové chromatografie. V současné době jsou v pivovarství používány zejména metody klasické HPLC. Ale i do této oblasti začínají pronikat techniky rychlé chromatografie založené na separaci na kolonách s částicemi menšími než 2 μm, neboli „sub-2- μm“, jejichž účinnost se s rostoucí lineární průtokovou rychlostí prakticky nemění. Jestliže k separaci použijeme takovéto kolony, mluvíme pak o ultra účinné kapalinové chromatografii (UHPLC), jejíž základní principy byly popsány v čísle 2, 2012 tohoto časopisu. Pomocí UHPLC lze dosáhnout stejně dobré, často i lepší separace než v HPLC módu, ale v podstatně kratších časech. Vyšší zpětné tlaky, které jsou důsledkem jemného zrnění UHPLC kolon, umožňují zvládnout nově vyvinutá speciální čerpadla, dokonalá těsnost celého systému a s tím spojená řada nových technických prvků tvořící UHPLC systém. Kromě rychlosti separace je další výhodou UHPLC velmi nízká spotřeba rozpouštědel (až desetinásobná úspora oproti HPLC) a nízké nástřiky vzorku na kolonu (1–2 μl).

UHPLC byla využita při vývoji nové metody stanovení cis- a transizomerů iso-α-kyselin v pivu. Parametry separace byly srovnávány s klasickou HPLC metodou běžně užívanou ve VÚPS (Výzkumný ústav pivovarský a sladařský); kromě rychlosti analýzy a účinnosti separace byly srovnávány hodnoty opakovatelnosti (r₉₅) dosažených výsledků z obou metod.

Separace iso-α-kyselin a jejich izomerů obsažených v pivu se běžně provádí na reverzní C18 stacionární fázi, mobilní fáze je tvořena pufrem či kyselinou v kyselé pH oblasti a organickým modifikátorem acetonitrilem (ACN). S vývojem stacionárních fází odolných v široké oblasti pH, tedy i v oblasti alkalické, vznikají metody separace, které využívají i tuto oblast pH (Hofta et al., 2007). Dobrá selektivita těchto kolon umožňuje stanovení iso-α-kyselin, jejich oxidačních produktů a různých forem hydrogenovaných iso-α-kyselin současně v jedné analýze. Metoda stanovení obsahu cis- a trans- izomerů iso- α-kyselin za neutrálních či slabě zásaditých podmínek (Harms et Nitzsche, 2001) byla využita v práci při stanovení změn poměru cis/trans forem během skladování piva při různých teplotách (Straková et al., 2007). Je však nutno podotknout, že v alkalickém prostředí dochází k přeměně a tedy posunu rovnováhy z α-kyselin na iso-α-kyseliny (Basařová et al., 2010). Dosud nebylo zdokumentováno, v jaké míře může tato izomerizace ovlivnit výsledek analýzy při separaci těchto látek v alkalickém prostředí.

Pro účely naší studie byla proto zvolena původní varianta s hodnotou pH mobilní fáze v kyselé oblasti.

2 MATERIÁL A METODY

Pro porovnání obou metod UHPLC a HPLC pro stanovení izomerů cis- a trans- iso-α-kyselin byla vybrána tuzemská piva vykazující hořkost v rozsahu 25–34 mg/l celkového obsahu iso-α-kyselin. Iso-α-kyseliny byly z piva izolovány technikou SPE na extrakčních kolonkách Phenomenex podle dříve popsaného postupu (Jurková et al., 2003).

V obou metodách byl použit jako externí standard mezinárodní kalibrační standard (ICS) dicyklohexylamin iso-α-kyselin s obsahem 62,3 % iso-α-kyselin označený DCHA-Iso, ICS-I3.

Zásobní roztok kalibračního standardu byl připraven navážením 20 mg ICS – I3 s přesností na 0,1 mg a rozpuštěním do 100 ml methanolu, gradient grade 99,8% (Merck), okyseleného kyselinou fosforečnou, p.a. (Merck), 0,5 : 1000 (v/v). Pro metodu HPLC byl zásobní roztok kalibračního standardu zředěn 10x, pro metodu UHPLC byl zředěn 20x, vždy okyseleným methanolem použitým pro zásobní kalibrační roztok.

Chromatografické podmínky HPLC

Separace byla provedena na koloně s reverzní fází (Alltima C18, 5 μm, 150 x 4,6 mm, Alltech) s předkolonkou C18 (4 x 3 mm, Phenomenex), za použití lineárního gradientu dvousložkové mobilní fáze (A) a (B). Fáze (A) byla tvořena ultračistou vodou (Millipore) s obsahem max. 5 ppb organických látek, okyselenou kyselinou fosforečnou na hodnotu pH 2,7. Fáze (B) byla tvořena ACN, gradient grade ≥ 99,9 % (Sigma Aldrich). Na počátku analýzy obsahovala mobilní fáze 52 % ACN, během 30minutové analýzy se obsah acetonitrilu li neárně zvýšil na 67 %. Ekvilibrační čas po skončení separace byl 10 minut. Průtok mobilní fáze byl 1,5 ml/min, teplota kolony byla 40 °C. Analyty byly detekovány v UV oblasti při 275 nm. Objem nástřiku na kolonu byl 10 μl.

K analýze byl použit kapalinový chromatograf SpectraSYSTEM (TSP, USA) s detektorem PDA. Sběr dat a vyhodnocení bylo provedeno chromatografickým softwarem ChromQuest pro Windows NT.

Chromatografické podmínky UHPLC

• UHPLC analýzy byly provedeny na koloně BEH C18 (2.1 x 50 mm I.D, velikost částic 1.7 μm), Waters, teplota kolony byla 40 °C, průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. K detekci byl použit UV detektor s diodovým polem (PDA), vyhodnocení bylo provedeno při vlnové délce 275 nm. Dvousložková mobilní fáze byla tvořena vodným roztokem (ultračistá voda, Millipore) kyselin nebo pufrem tak, aby se hodnoty pH mobilní fáze pohybovaly v rozmezí 1,6 až 3,08 (A) a acetonitrilem (B). V průběhu optimalizace metody byly použity následující mobilní fáze:TFA, pH 1,6 (0,1% TFA obj., připravena přidáním 100 μl koncentrované TFA; 99.95% ULC/MS, Biosolve, Netherlands) do 100 ml ultračisté vody;

• TFA, pH 2,7 (0,01% TFA obj. připravena přidáním 10 μl koncentrované TFA; 99.95% ULC/MS, Biosolve, Netherlands) do 100 ml ultračisté vody; použitím této mobilní fáze bylo dosaženo nejlepší separace, proto byla vybrána jako optimální (viz sekce „3. Výsledky a diskuse“);

• Mravenčan amonný, 5 mM, pH 3,08 (připraven titrací 5 mM kyseliny mravenčí 99%, Merck, Německo, vodným roztokem hydroxidu amonného 29%, A. C. S. reagent Sigma–Aldrich, Německo, do požadovaného pH 3,08).

Gradientová eluce byla optimalizována s ohledem na minimální čas analýzy a dosažení maximálního rozlišení stanovovaných látek. Gradient s počátkem 48% fáze (B) lineárně vzrůstal do 55% (B) za 11 minut. Následoval 2minutový isokratický krok při obsahu 55% (B) a 3minutový ekvilibrační krok při počátečních podmínkách 48% (B). Objem nástřiku na kolonu byl 2 μl.

UHPLC analýzy byly provedeny na kapalinovém chromatografu Acquity UPLCTM (Waters) s 2996 PDA detektorem operujícím v rozmezí vlnových délek od 194 do 600 nm. Data byla vyhodnocována softwarem Empower 2 (Waters). Chromatogramy k interpretaci byly extrahovány při vlnové délce 275 nm, sample rate byl nastaven na hodnotu 20 pts s⁻¹ a filtrační konstanta na hodnotu 0.5.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Na obr. 1 je uveden UHPLC chromatogram rozdělených izomerů iso-α-kyselin, na obr. 2 je pro srovnání uveden HPLC chromatogram, oba chromatogramy byly naměřeny za optimálních podmínek uvedených v kapitole 2 pro dané metody. Chromatogram potvrzuje tvrzení, že UHPLC metoda je rychlejší, v tomto případě 2,5 krát při porovnání celkového času analýzy. V případě UHPLC má poslední eluující pík cis-iso-ad-humulonu retenční čas 4,9 min, celá délka analýzy včetně vymývacího kroku je 13 min, ekvilibrace byla 3 min, celkem tedy 16 min. V případě HPLC analýzy eluoval poslední stanovovaný pík cis-iso-ad-humulonu ve 12. minutě, celková analýza trvala 30 min, ekvilibrační krok 10 min, celkem tedy 40 min. V obou případech pokračuje gradient i po eluci iso-sloučenin z důvodu eluujích zbytkových α- a β-kyselin, jejichž retence je vyšší než retence iso-α-kyselin. Jestliže stanovení α- a β-kyselin není požadováno (zkrácená verze metody), lze gradient zkrátit zařazením rychlého vymývacího kroku s vysokým procentem organické fáze po 5. minutě v UHPLC a po 12. minutě v HPLC módu (viz obr. 1 a 2). Bez tohoto vymývacího kroku by se α- a β-kyseliny na koloně hromadily a postupně interferovaly v následných měřeních. V takovém případě se ukazuje, jak markantní je rozdíl mezi oběma metodami nejen v časové prodlevě, ale i v celkové spotřebě organického rozpouštědla. Ta činí v hrubém odhadu při celém gradientu 32 ml/10 vzorků v módu UHPLC a 360 ml/10 vzorků v módu HPLC. To potvrzuje více jak 10násobnou úsporu organických rozpouštědel, kterou jsme avizovali v předchozím článku.

Obr. 1 UHPLC chromatogram reálného vzorku piva

Eluce prostorových izomerů iso-kyselin v pořadí: trans-iso-co-humulon (2,7 min), cis-iso-co-humulon (3,0 min), trans-iso-n-humulon (3,7 min), cis-iso-n-humulon (4,0 min), trans-iso-ad-humulon (4,4 min), cis-iso-ad-humulon (4,9 min).

Obr. 2 HPLC chromatogram reálného vzorku piva

Eluce prostorových izomerů iso-kyselin v pořadí: trans-iso-co-humulon (6,6 min), cis-iso-co-humulon (7,5 min), trans-iso-n-humulon (8,8 min), cis-iso-n-humulon (9,4 min), trans-iso-ad-humulon (10,5 min), cis-iso-ad-humulon (11,8 min).

Při převodu metody HPLC na UHPLC a její optimalizaci bylo zjištěno, že jsou retenční časy studovaných látek, izomerů iso-α-kyselin, výrazně ovlivňovány pH mobilní fáze. I malé změny pH ve sledovaném intervalu pH (1,6 až 3,08) se projeví velkým posunem retencí při shodném gradientu organického modifikátoru. Při pH 2,7 (0,01% TFA) bylo dosaženo velmi dobré separace iso-α-kyselin v módu UHPLC, kdy retenční čas posledního eluujícího píku iso-látky (cis-iso-ad-humulon) byl 4,9 min. Toto pH bylo zvoleno jako optimální i vzhledem k jeho použití k separaci iso-α-kyselin v HPLC módu, kdy retenční čas tohoto píku je 12 min. Snížení pH na hodnotu 1,6 (0,1% TFA) vedlo k téměř čtyřnásobnému prodloužení retenčních časů. Poslední eluující pík cis-iso-ad-humulon měl retenční čas 19 min a navíc píky trans-iso-ad-humulonu a cis-iso-nhumulonu nebyly rozdělené. Naopak zvýšení pH na hodnotu 3,08 (5 mM mravenčan amonný) se projevilo výrazným zkrácením retenčních časů. Všechny izomery iso-α-kyselin eluovaly v rozmezí 1. a 2. minuty, izomerní formy trans- a cis- však nebyly ani u jedné z kyselin od sebe rozděleny.

Při testování vhodných aditiv do vodné mobilní fáze byly srovnávány TFA, kyselina mravenčí a kyselina fosforečná. Kyselina fosforečná je běžně používaná v původní HPLC metodice. Ukázalo se však, že tato kyselina není vhodná v UHPLC módu, neboť píky eluovaných látek byly značně deformované. Nejlepších separačních parametrů bylo dosaženo za použití TFA, proto byla zvolena jako optimální aditivum. Při optimalizaci gradientu bylo nutné snížit počáteční procento organické fáze na 48 %, neboť při stejném procentu jako v HPLC (52 %) dochází v UHPLC k rychlé eluci nedostatečně separovaných iso-látek. Toto sledování opět koreluje s teorií UHPLC, kdy separované látky procházejí UHPLC kolonou za mnohem vyššího tlaku (až pětinásobného) než v případě HPLC. V gradientu byla upravena také hodnota konečného procenta organického modifikátoru, místo původních 67 % stačilo k separaci látek 55 % ACN. Konečně i doba lineárního gradientu byla zredukována z 30 na 11 min.

Posledním krokem byla optimalizace nástřiku. Jestliže se v HPLC používá chromatografická kolona o rozměrech 150 x 4,6 mm a metoda UHPLC využívá kolony s mnohem menším vnitřním objemem, tj. s rozměry 50 x 2,1 mm, musí dojít zákonitě při převodu metody ke zmenšení dávkovaného objemu. Při nástřicích vyšších než 2 μl docházelo k přetížení UHPLC kolony, které se projevilo rozštěpením píků. Při dávkování objemu 2 μl bylo dosaženo optimálního rozdělení všech stanovovaných látek s vyhovující citlivostí, která odpovídala kvantifikačním limitům dané metody. Nově optimalizovaná UHPLC metoda byla srovnána se stávající HPLC metodou z hlediska opakovatelnosti. Ta byla zjištěna z hodnot koncentrací izomerů iso-α-kyselin ve 4 reálných vzorcích piv u obou metod, každý vzorek byl měřen dvakrát. Vyhodnocení bylo provedeno na základě změřených ploch píků odpovídajících trans- a cis- formám iso-co-humulonu, iso-adhumulonu a iso-n-humulonu. Výsledky stanovení a hodnoty opakovatelnosti pro jednotlivé formy cis- a trans- iso-α-kyselin a pro celkové koncentrace iso-α-kyselin v obou systémech HPLC i UHPLC jsou uvedeny v tab. 1 a 2. Opakovatelnost r₉₅ byla vypočítána podle vzorce r₉₅ = sᵣ x 2,8, kde sr je směrodatná odchylka vypočítaná pro různé, ale podobné vzorky měřené za podmínek opakovatelnosti:

sᵣ² = ΣDᵢ²/2n, kde Dᵢ je rozpětí hodnot dvou stanovení.

Tab. 1 Stanovení cis- a trans- forem iso-α-kyselin metodou HPLC

Tab. 2 Stanovení cis- a trans- forem iso-α-kyselin metodou UHPLC

Metoda UHPLC poskytuje lepší nebo srovnatelnou opakovatelnost s metodou HPLC pro všechny cis- a trans- formy iso-α-kyselin s výjimkou cis-formy co-humulonu a n-humulonu, který je s lepší opakovatelností měřen metodou HPLC. Tento jev lze přisuzovat lepší geometrii většiny píků při UHPLC separaci, která se projeví v přesnější integraci a tím i kvantifikaci.

Dále lze konstatovat, že metoda UHPLC je schopna poskytnout výsledky s menším rozptylem a je tedy přesnější v určení koncentrací trans- forem, které jsou považovány za jeden z indikátorů vypovídajících o stabilitě nebo stárnutí piva během jeho skladování nebo transportu.

Tab. 3 sumarizuje popsané rozdíly a výhody nové UHPLC metody ve srovnání s původní HPLC.

Tab. 3 Srovnání parametrů metod UHPLC a HPLC

4 ZÁVĚR

Nová generace kapalinové chromatografie UHPLC založená na vyspělejší přístrojové technice je přínosem nejen ekonomickým (kratší doba analýz s malými spotřebami rozpouštědel), ale také posouvá pivovarskou analytiku do oblasti přesnějšího měření s menším rozptylem výsledků, jak bylo v této studii demonstrováno na příkladu stanovení prostorových izomerů iso-α-kyselin.