Přenos metod z LC Agilent řady 1100 na LC Agilent 1260 Infinity III

Přenos metod z původních přístrojů na nové systémy, jako je Agilent 1260 Infinity III LC, je důležitým tématem pro všechny laboratoře v různých odvětvích. Bezproblémový přenos metod zajišťuje, že lze nadále používat stávající metody, což znamená kontinuitu provozu a snížení regulačních i finančních rizik.

Tento technický přehled demonstruje přenos metod z Agilent 1100 Series Quaternary LC na Agilent 1260 Infinity III LC pro konvenční LC metody zahrnující různé gradientové podmínky. Bylo dosaženo ekvivalentních výsledků, což dokazuje, že u běžných robustních konvenčních LC metod lze očekávat bezproblémový přenos. Z hlediska přesnosti retenčních časů 1260 Infinity III LC překonává 1100 LC, což vede k vyšší důvěře v data.

Úvod

Přenos metod je důležitým tématem pro všechny laboratoře v různých odvětvích, kde se metody HPLC přenášejí mezi odděleními a lokalitami, jakož i mezi různými LC přístroji.¹ U validovaných metod ve farmaceutickém průmyslu je přenositelnost metod povinná.

Přenos metod, neboli přenos analytických postupů z jedné laboratoře do druhé ve farmaceutickém průmyslu, vyžaduje zdokumentovaný proces, který vyžaduje srovnávací testování.² Jedním z příkladů přenosu metod mezi přístroji je přenos konvenčních LC metod ze starších zařízení na nové přístroje, jako je 1260 Infinity III LC.

Tento technický přehled demonstruje přenos metod z 1100 Series Quaternary LC na 1260 Infinity III LC pro konvenční LC metody. Bylo vybráno několik metod, které pokrývají různé gradientové podmínky, včetně náročných podmínek, jako je pomalý gradient a gradient začínající v extrémním složení. To by mělo prokázat, že při přenosu metod z širokého aplikačního prostoru konvenčních LC metod z kvarterního LC systému řady 1100 do LC systému 1260 Infinity III jsou získány ekvivalentní výsledky.

Experimentální část

Instrumentace

LC systém Agilent řady 1100 se skládal z následujících modulů:

• Kvarterní čerpadlo Agilent 1100 Series (G1311A) s aktivním vstupním ventilem (AIV)
• Odplyňovač Agilent 1100 Series (G1322A)
• Standardní autosampler Agilent 1100 Series (G1313A)
• Termostatovaná kolona Agilent 1100 Series (G1316A)
• Detektor diodového pole Agilent řady 1100 (G1315B) se standardní průtokovou celou, 10 mm, (G1315-60022)

Systém LC Agilent 1260 Infinity III se skládal z následujících modulů:

• Kvarterní čerpadlo Agilent 1260 Infinity III (G7111B) s aktivním vstupním ventilem (AIV)
• Vialsampler Agilent 1260 Infinity III (G7129C)
• Termostat pro více kolon Agilent 1260 Infinity III (G7116A)
• Detektor diodového pole Agilent 1260 Infinity III WR (G7115A) se standardní průtokovou celou, 10 mm, (G1315-60022)

Software

• Agilent OpenLab CDS, verze 2.7.

Kolony

• Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 × 150 mm, 5 μm (číslo dílu 959993-902)
• Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 × 50 mm, 3,5 μm (číslo dílu 959943-902)
• Agilent ZORBAX SB-C18, 4,6 × 150 mm, 5 μm (číslo dílu 883975-902)

Chemikálie

Všechna použitá rozpouštědla byla v LC kvalitě. InfinityLab Acetonitrile Gradient Grade pro LC (číslo dílu 5191-5100)* a InfinityLab Methanol Gradient Grade pro LC (číslo dílu 5191-5110)* byly zakoupeny od společnosti Agilent. Čerstvá ultračistá voda byla získána ze systému Milli-Q Integral vybaveného 0,22 μm membránovou kazetou (Millipak). Izokratický vzorek (číslo dílu 01080-68704) a RRLC checkout (číslo dílu 5188‑6529) byly od společnosti Agilent. Teofylin a kofein byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (Steinheim, Německo). Teobromin a kyselina fosforečná byly získány od společností Alfa Aesar (Karlsruhe, Německo) a VWR (Darmstadt, Německo). Suchý extrakt z plodnic Ganoderma Lucidum (referenční standard USP) byl zakoupen od společnosti VWR (Darmstadt, Německo).

*K dispozici pouze v některých zemích

Příprava vzorku purinového alkaloidu

Vzorek obsahující 100 μg/ml kofeinu, teobrominu a teofylinu ve vodě:acetonitrilu (98:2; v/v) byl připraven následovně: 25 mg kofeinu, teobrominu a teofylinu bylo odváženo do 25ml odměrné baňky. Poté bylo přidáno 5 ml acetonitrilu a 15 ml vody a standardy byly rozpuštěny pomocí ultrazvukové lázně. Vzorek byl doplněn vodou na požadovaný objem. Poté byl 1 ml výsledného vzorku o koncentraci 1 mg/ml zředěn vodou na 10 ml. Vzorek byl filtrován pomocí injekčního filtru Agilent Captiva Premium, regenerovaná celulóza, 0,2 μm (číslo dílu 5190-5310).

Příprava vzorku Ganoderma

Odvážilo se 50 mg vzorku suchého extraktu plodnice Ganoderma Lucidum a přidalo se 5 ml methanolu. Směs se sonifikovala po dobu pěti minut a poté se centrifugovala při 10 000 ot/min po dobu pěti minut. Supernatant se filtroval pomocí injekčního filtru Captiva Premium, nylon, 0,2 μm (číslo dílu 5190‑5088).

Metoda (1) pro izokratický vzorek

• Vzorek: izokratický vzorek
• Kolona: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 × 150 mm, 5 µm
• Mobilní fáze:
  • A: voda
  • B: acetonitril
  • C: acetonitril
  • D: voda
• Gradient: Izokratická eluce, buď 35 % A a 65 % B, nebo 65 % C a 35 % D
• Stop time: 20 minut (resp. 12 minut při 80 °C)
• Průtok: 1,000 mL/min
• Teplota: 40 °C nebo 80 °C
• Detekce: 254/4 nm, referenční 360/100 nm, frekvence 10 Hz
• Objem nástřiku: 5 µL

Metoda (2) využívající gradient začínající na nízkém %B.

• Vzorek: purinové alkaloidy
• Kolona: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 × 50 mm, 3.5 µm
• Mobilní fáze:
  • A: voda
  • B: acetonitril
• Gradient:
  • 0 min: 1 % B
  • 15 min: 15 % B
• Stop time: 20 minut
• Post-run: 10 minut
• Průtok: 0,960 mL/min
• Teplota: 40 °C
• Detekce: 273 nm/4 nm, referenční 360 nm/100 nm, frekvence 20 Hz
• Objem nástřiku: 15 µL

Metoda (3) využívající rychlý gradient

• Vzorek: RRLC checkout
• Kolona: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 × 50 mm, 3.5 µm
• Mobilní fáze:
  • A: voda
  • B: acetonitril
• Gradient:
  • 0 min: 20 % B
  • 6,5 min: 90 % B
• Stop time: 8 minut
• Post-run: 4 minuty
• Průtok: 3,000 mL/min
• Teplota: 40 °C
• Detekce: 245 nm/4 nm, referenční 360 nm/100 nm
  • 40 Hz (1260 Infinity III LC)
  • 20 Hz (1100 Series LC)
• Objem nástřiku: 15 µL

Metoda (4) využívající pomalý gradient

• Vzorek: extrakt z Ganoderma lucidum
• Kolona: Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 × 150 mm, 5 µm
• Mobilní fáze:
  • A: 0,075% kyselina fosforečná ve vodě
  • B: acetonitril
• Gradient:
  • 0 min: 20 % B
  • 3 min: 26,5 % B
  • 34 min: 26,5 % B
  • 52 min: 38,5 % B
  • 54 min: 100 % B
• Stop time: 55 minut
• Post-run: 15 minut
• Průtok: 1,919 mL/min
• Teplota: 30 °C
• Detekce: 257 nm/4 nm, referenční 370 nm/60 nm, frekvence 20 Hz
• Objem nástřiku: 10 µL

Výsledky a diskuse

Aby se prokázalo, že při přenosu konvenčních metod LC z LC řady 1100 na LC 1260 Infinity III jsou získány ekvivalentní výsledky, byly zkoumány metody pokrývající různé gradientové podmínky (viz popis metod výše).

Pro izokratickou analýzu jsou výsledky získané pomocí LC 1260 Infinity III a LC 1100 znázorněny na obrázku 1. Byla pozorována vynikající přesnost retenčního času a maximální odchylka retenčního času mezi oběma LC systémy je 0,5 %. Kromě toho jsou retenční časy a jejich reprodukovatelnost srovnatelné při použití čerpadlových kanálů A a B nebo C a D pro analýzu (data nejsou uvedena).

Agilent: Obrázek 1. Analýza izokratického vzorku pomocí metody izokratické analýzy (metoda 1) při teplotě kolony 40 °C. N = 10 pro výpočet RSD.

Pro zkoumání vlivu teploty v komoře kolony byla izokratická analýza provedena také při zvýšené teplotě 80 °C. Byla získána vynikající přesnost retenčního času. Retenční časy byly při použití LC 1260 Infinity III mírně nižší ve srovnání s LC 1100, s maximální odchylkou retenčního času 3,2 % (obrázek 2). Možným vysvětlením tohoto mírného rozdílu v retenčním čase je konstrukce komory kolony, konkrétně to, že MCT poskytuje větší odolnost vůči okolní teplotě díky zvýšené izolaci dvířek MCT, což může nakonec způsobit, že většina analytů eluuje dříve.

Agilent: Obrázek 2. Analýza izokratického vzorku pomocí metody pro izokratickou analýzu (metoda 1) při teplotě kolony 80 °C. N = 10 pro výpočet RSD.

Práce s extrémními složeními představuje výzvu pro kvartérní pumpy. Pro zkoumání přenosu metody využívající extrémní podmínky složení byl analyzován vzorek purinových alkaloidů pomocí gradientu začínajícího na 1 % B. Byla pozorována vynikající přesnost retenčních časů, přičemž systém 1260 Infinity III LC jasně překonal systém 1100 LC (viz obrázek 3). Retence na obou LC systémech byla srovnatelná, s maximální odchylkou 2,4 %.

Agilent: Obrázek 3. Analýza vzorku purinového alkaloidu pomocí gradientové metody, která začíná s nízkým %B (metoda 2). N = 10 pro výpočet RSD.

Pro posouzení přenosu metody s rychlým gradientem byla provedena analýza RRLC checkout pomocí gradientu v rozmezí 20 až 95 % B během 6,5 minut při vysokém průtoku 3,0 ml/min. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4. Na obou LC systémech byla dosažena vynikající přesnost retenčních časů a byla pozorována vynikající shoda retenčních časů s maximální odchylkou retenčního času 0,04 minuty.

Agilent: Obrázek 4. Analýza RRLC checkout pomocí metody rychlého gradientu (metoda 3). N = 10 pro výpočet RSD.

Kromě extrémních složení představují pro kvaternární pumpy výzvu také pomalé gradienty. Metoda analýzy extraktu Ganoderma (metoda 4) založená na metodě USP compendial³ využívá pomalý gradient. Výsledky získané přenosem této metody z LC 1100 na LC 1260 Infinity III jsou znázorněny na obrázku 5. S LC 1260 Infinity III je dosaženo vynikající přesnosti retenčního času, která převyšuje LC 1100. Retenční časy jsou mezi oběma LC systémy ekvivalentní, s maximální odchylkou retenčního času 1,0 %.

Agilent: Obrázek 5. Analýza extraktu Ganoderma pomocí pomalého gradientu (metoda 4). N = 6 pro výpočet RSD.

Přenos vybraných konvenčních LC metod z širokého aplikačního prostoru z kvaternárního LC systému řady 1100 do LC systému 1260 Infinity III ukazuje, že na obou LC systémech jsou dosaženy ekvivalentní výsledky, přičemž LC systém 1260 Infinity III překonává LC systém 1100 z hlediska přesnosti retenčního času. To dokazuje, že lze očekávat ekvivalentní výsledky při přenosu typických, robustních, konvenčních LC metod z kvaternárního LC systému řady 1100 do LC systému 1260 Infinity III. Vyšší pravděpodobnost rozdílů mezi výsledky získanými pomocí kvaternárního LC systému řady 1100 a LC systému 1260 Infinity III však může existovat za určitých podmínek, jako jsou nízké průtoky, náročné gradienty, teplotně citlivé analyty a jejich kombinace.

Závěr

Přenos konvenčních LC metod pokrývajících různé gradientové podmínky z Agilent 1100 Series Quaternary LC do Agilent 1260 Infinity III LC vede k ekvivalentním výsledkům, což dokazuje, že lze očekávat plynulý přenos metod pro typické, robustní, konvenční LC metody. Z hlediska přesnosti retenčního času překonává 1260 Infinity III LC 1100 LC, což vede k vyšší důvěryhodnosti dat.