HPLC analýza sacharidů/cukrů pomocí FID

Odezva FID na oba cukry je ekvivalentní v rámci chyby a roste lineárně s koncentrací od 10 do 1000 ppm.

Úvod

Kvantitativní analýza cukrů neboli sacharidů je důležitá při vývoji potravin, biopaliv a léčiv. HPLC je nejběžnější technika pro analýzu cukrů, avšak neexistuje žádný detektor, který by mohl poskytnout jednotnou odezvu na různé cukry během gradientové eluce. Data znázorněná na obrázku 1, ukazují konzistentní odezvu sacharózy při změně mobilní fáze z vodné na organickou.

ARC: Obrázek 1. Konzistentní odezva sacharózy s různým složením mobilní fáze

Analyzovali jsme dva sacharidy, maltoheptaozu a maltotriozu, od cca 10 ppm až do 1000 ppm za použití gradientové HPLC a detektoru Solvere

Detekční schéma se skládá z

• katalytického rotačního disku, který usnadňuje odstranění rozpouštědla
• následné katalytické spalování
• detekce pomocí katalytické FID

Tato technika umožňuje univerzální odezvu na uhlík, protože jsou všechny atomy uhlíku převedeny na metan a následně detekovány pomocí FID.

ARC: Schéma detekce pomocí univerzálního HPLC detektoru Solvere

Experimentální část

Vzorky maltoheptaozy (M7753, Sigma Aldrich) a hydrátu maltotriozy (851493, Sigma Aldrich) byly rozpuštěny ve vodě čistoty pro HPLC a zředěny.

ARC: Obrázek 2. Struktura maltoheptaozy (vlevo) a hydrátu maltotriozy (vpravo)

Vzorky byly analyzovány na systému Agilent 1290 Infinity II LC a koloně (Zorbax SB-C18, Agilent), která byla připojena k detektoru Solvere (v1, ARC) pomocí kapiláry 300 mm x 0,12 mm ID 316SS a následující konfigurace:

Podmínky HPLC

• Kolona: Zorbax SB-C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 μm)
• Objem nástřiku: 20 μL
• Průtok čerpadla: 0,3 ml/min
• Rozpouštědlo A: Voda, 0,1% kyselina mravenčí
• Rozpouštědlo B: Acetonitril
• Profil gradientu: Čas (min) / % B:
  • 0 / 10
  • 1 / 10
  • 3 / 95
  • 13 / 95
  • 13.1 / 10
  • 20 / 10

Podmínky detektoru Solvere

• Teplota cely: 120 °C
• Teplota FID: 400 °C
• H₂: 50 sccm
• Vzduch: 350 ccm
• Make-up: 500 sccm (vzduch)
• Tlak: 5 psig
• Rychlost sběru dat: 3,125 Hz
• Výkon: 80%
• Katalyzátor: S1-M

Výsledky a diskuse

Obrázek 3 ukazuje odezvu detektoru jako funkci času pro maltoheptaozu a maltotriozu při koncetraci 497 a 506 ppm (μg/ml), v daném pořadí. Maltoheptaoza je zobrazena jako menší pík před primárním píkem s vyšší koncentrací.

Procha tohoto píku byla zahrnuta do výpočtu odezvy na cukr, protože tyto sloučeniny byly zakoupeny jako čisté standardy. Předpokládá se, že se jedná o nečistotu v cukru. Tvary píku mají gaussovský tvar s 1,53 a 1,24 (tailing factors) pro maltoheptaozu a hydrát maltotriozy, v daném pořadí, a šířky píku (FWHM) 0,115 a 0,195 min.

ARC: Obrázek 3. Překrytí chromatogramů maltoheptaozy (modrá, tlustá) a maltotriozy (černá, tenká) při 500 ppm

Integrované odezvy pro každý cukr jsou znázorněny na obrázku 4 od cca 10 až do 1000 ppm. Odezvy jsou lineární v celém rozsahu s korelačními koeficienty 0,9992 a 0,99996. Obě sloučeniny poskytují podobnou odezvu na uhlík. Minimální detekční limity metody (MDL) byly vypočteny na základě signálu potřebného k poskytnutí poměru signálu k šumu 3. MDL byly vypočteny jako 15,55 ppm a 30,44 ppm pro maltoheptaózu a maltotriózu, v daném pořadí.

ARC: Obrázek 4. Integrovaná odezva maltoheptaozy (oranžové trojúhelníky) a hydrátu maltotriozy (modré čtverečky) jako funkce koncentrace uhlíku ve vzorcích od 10 do 1000 ppm.

Závěr

• Univerzální HPLC detektor Solvere poskytuje ekvimolární uhlíkovou odezvu pro maltoheptaozu a maltotriozu
• Odezva je lineární od 10-1000 ppm
• Detekční limity metody jsou v aktuální konfiguraci 15 - 30 ppm