Systematický přístup k chirálnímu screeningu a vývoji metod

• Jak vyberu správnou chirální stacionární fázi pro svou analyzovanou látku?
• Jak na základě struktury analyzované látky určím, kterou kolonu použít?
• Potřebuji chirální kolonu v reverzní fázi pro separaci X?

Chromatografická separace nastává, když kombinace stacionární fáze a mobilní fáze vytvoří prostředí, ve kterém se projeví selektivita mezi analyty s odlišnými chemickými vlastnostmi. Například v chromatografii na reverzní fázi jsou látky zadržovány stacionární fází na základě hydrofobních interakcí a poté eluovány v pořadí podle vzrůstající hydrofobnosti. U enantiomerů jsou chemické a fyzikální vlastnosti identické, a proto je k jejich separaci nutná určitá forma chirálního rozpoznávání.

Mechanismus chirální separace zahrnuje tvorbu diastereomerního komplexu, buď mezi aditivem mobilní fáze a analyzovanou látkou, nebo mezi stacionární fází a analyzovanou látkou. Po jeho vytvoření je pak možné enantiomery oddělit, buď proto, že diastereomerní komplex má odlišné vlastnosti, nebo díky stabilitě vytvořeného komplexu, kdy je jeden enantiomer zadržován přednostně před druhým. Použití chirálních modifikátorů v mobilní fázi je sice možné, ale v HPLC se obecně nepoužívá (ačkoli se používá v kapilární elektroforéze), protože náklady na tyto modifikátory činí tuto možnost ve většině případů ekonomicky neproveditelnou. Mezi typy chirálních stacionárních fází používaných v průběhu let patří:

• Pirkle fáze – Plně syntetické fáze na bázi funkcionalizovaných aminokyselin, které poskytují chirální rozpoznávání díky třem bodům interakce. Materiály jsou obecně kovalentně vázané, takže mají dobrou odolnost. Tyto typy fází obecně vykazují nízkou úspěšnost, ale při správné funkci nabízejí dobrou selektivitu.
• Fáze na bázi cyklodextrinu – Plně syntetické vázané fáze pracující na principu inkluzní komplexace, kdy jeden enantiomer lépe zapadne do dutiny cyklodextrinu než druhý.“
• Fáze na bázi proteinů – Proteiny, jako je BSA, jsou naneseny na oxid křemičitý a nabízejí širší spektrum chirálních interakcí. Rozlišení nebývá tak dobré jako u dvou předchozích typů (Pirkle nebo cyklodextrinových fází), ale tyto kolony poskytují širší selektivitu. U fází na bázi proteinů je třeba dbát na to, aby nedošlo k deaktivaci fáze nebo k jejímu vymytí z nosiče oxidu křemičitého během používání.
• Výměna ligandů – Mechanismus výměny ligandů využívá penicilamin v kombinaci s mobilní fází obsahující ionty mědi(II). Tyto ionty tvoří komplexy s aminokyselinami, což umožňuje jejich separaci.
• Fáze na bázi polysacharidů – Jsou založeny na přirozeně se vyskytujících chirálních polymerech, jako je celulóza nebo amylóza. Tyto polymery jsou derivatizovány, aby poskytovaly další interakce. V závislosti na použitých rozpouštědlech polymery nábobtnávají v různé míře, což vytváří „chirální kapsy“ uvnitř struktury, které umožňují vstup a výstup analytů a tím jejich separaci. Mezi nejnovější vývoj v této oblasti patří imobilizace těchto fází, která umožňuje použití širšího spektra rozpouštědel. Lze tak využít i rozpouštědla jako DMSO a DMF, což je užitečné zejména při přípravných separacích, kde může být rozpustnost analytů problematická.

Vzhledem k flexibilitě, kterou polysacharidové fáze nabízejí – umožňují totiž provádět separace v normální fázi, reverzní fázi, polární organické fázi i SFC s vysokou účinností – staly se tyto fáze nejčastější volbou pro mnoho uživatelů provádějících chirální separace. Fáze vykazují vysokou úspěšnost, což zvyšuje pravděpodobnost nalezení podmínek, které zajistí účinnou separaci. 

Vzhledem ke komplexní povaze interakcí mezi enantiomery a chirální stacionární fází nelze spolehlivě předpovědět, která fáze poskytne dobrou separaci. Je proto nutné testovat různé stacionární fáze i složení mobilní fáze, aby se určila nejvhodnější kombinace.

Při screeningu naší řady polysacharidových fází Lux™ testujeme všechny tři režimy – normální fázi, reverzní fázi a polární organický režim – současně. Kolony Lux lze také úspěšně použít za podmínek SFC, pokud mají uživatelé k dispozici tuto technologii. Testujeme následující fáze:

• Lux Cellulose 1
• Lux Cellulose 2
• Lux Cellulose 3
• Lux i-Cellulose 5
• Lux Amylose 1
• Lux i-Amylose 1
• Lux i-Amylose 3

Screening lze také provést v podmínkách kompatibilních s LC-MS, pokud je to nezbytné. Přesné podrobnosti o screeningu jsou uvedeny na posteru o chirálním screeningu. Po dokončení screeningu je nutné vyhodnotit výsledky a vybrat jednu či dvě nejslibnější podmínky k další optimalizaci. Tento postup se ukázal jako nejúčinnější způsob vývoje chirálních separací s dobrým rozlišením a vysokou robustností.