Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2025 - Den 4

Středeční den zahájil Ivo Novotný z LabRulez úvodní přednáškou mediálního partnera na téma „Chromatografie v praxi“, která shrnula aktuální trendy a aplikace v oblasti HPLC a LC-MS. Následně Marek Minárik ze společnosti Watrex představil inovativní koncept Repetto LC, díky němuž lze dosáhnout extrémního účinku až 360 000 teoretických pater v koloně.

Hlavním bodem dopoledního programu byla sekce „Nebojte se HILIC“ vedená Lucií Novákovou. Ta ve svém tutoriálu podrobně vysvětlila principy a optimalizační strategie hydrofilní interakční chromatografie (HILIC), která je klíčová pro separaci polárních analytů. Zazněly také historické souvislosti a vývoj moderních stacionárních fází.

Michal Douša z firmy Zentiva navázal aplikovaným pohledem na HILIC v praxi, zejména v rámci farmaceutického vývoje. Prezentoval konkrétní případy analýzy vysoce polárních sloučenin bez chromoforu s využitím hmotnostní detekce, jako například stanovení dimethylaminu v metforminu.

Závěrečná odborná přednáška patřila Miroslavu Kubátovi z Univerzity Pardubice, který představil bioanalytické využití HILIC separací – od stanovení aminokyselin v kávě až po cílenou metabolomiku glutathionu. Popsal možnosti využití této techniky v klinickém výzkumu a monitoringu oxidačního stresu či intoxikací.

Program uzavřelo slavnostní vyhlášení nejlepšího plakátového sdělení a závěrečná řeč Lucie Novákové, která shrnula hlavní přínosy dne a podtrhla důležitost sdílení znalostí v oblasti moderní separační analýzy.

HPLCcz: Dotaznik spokojenosti Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2025

Středa 21. 05. 2025

09:00 – 09:10 Přednáška mediálního partnera: Chromatografie v praxi: Od základů k aktuálním TOP aplikacím HPLC a LC-MS

• Ivo Novotný (LabRulez)

HPLC.cz: Den 4 - Přednáška mediálního partnera - Chromatografie v praxi - Od základů k aktuálním TOP aplikacím HPLC a LC-MS (Ivo Novotný, LabRulez)

09:10 – 09:20 Přednáška sponzora sekce: Princip Repetto LC aneb jak dosáhnout na koloně 360.000 pater a rozdělit i nerozdělitelné

• Marek Minárik (Watrex)

HPLC.cz: Den 4 - Přednáška sponzora sekce - Princip Repetto LC aneb jak dosáhnout na koloně 360.000 pater a rozdělit i nerozdělitelné (Marek Minárik, Watrex)

SEKCE 8: NEBOJTE SE HILIC (předseda O. Novák)

09:20 – 10:10 Jak na HILIC – tutoriál

• Lucie Nováková 

Hydrofilní interakční chromatografie (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) je důležitou technikou pro separaci polárních sloučenin, které jsou často špatně zadržovány v systému reverzních fázích. HILIC metoda využívá polární stacionární fázi a mobilní fázi s vysokým obsahem organického rozpouštědla, obvykle acetonitrilu, čímž umožňuje efektivní retenci a separaci širokého spektra polárních analytů. Separační mechanismus HILIC zahrnuje kombinaci několika interakcí, přičemž tou hlavní je rozdělování mezi mobilní fází a hydrofilní vodnou vrstvou, která se vytváří na povrchu stacionární fáze, a dále elektrostatické interakce, vodíkové vazby a dipólové interakce. 

Tento komplexní mechanismus je silně ovlivněn složením mobilní fáze, pH, iontovou silou a typem stacionární fáze, což vyžaduje pečlivou optimalizaci těchto parametrů. Optimalizace HILIC metody tedy zahrnuje výběr vhodné stacionární fáze, složení mobilní fáze, nastavení pH a koncentrace solí, správné nastavení gradientové eluce, zejména pak přístupu ekvilibrace mobilní fáze. Podobně jako v jiných chromatografických metodách, faktorem změny selektivity může být i teplota. Ve srovnání s jinými chromatografickými módy hraje výraznější roli rozpouštědlo vzorku a dávkovaný objem.

Historie HILIC sahá až do 70. let, kdy byla poprvé popsána jako technika zaměřená na separaci sacharidů. V posledních desetiletích se však stala jednou z nejvíce používaných technik pro analýzu polárních látek v oblastech, jako jsou metabolomika, farmaceutická analýza, klinická chemie a environmentální vědy. Vývoj nových stacionárních fází, včetně chemicky modifikovaného silikagelu, polymerních matric a hybridních materiálů, výrazně rozšířil možnosti použití této techniky.

Navzdory mnoha výhodám přináší HILIC několik výzev, včetně problémů s reprodukovatelností, komplexních retenčních mechanismů a interakcí mezi matricí vzorku a stacionární fází. Přesné pochopení těchto faktorů a správná volba chromatografických podmínek jsou klíčem k úspěšné aplikaci této techniky.

HPLC.cz: Den 4 - Jak na HILIC – tutoriál (Lucie Nováková)

10:10 – 10:40 HILIC v praxi: Řešení výzev farmaceutického vývoje

• Michal Douša 

Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) has inherent advantages in the separation of hydrophilic or strongly polar substances due to strong hydrophilic interactions, which represents an attractive complementary approach to the reversed phase [1]. HILIC separations can be easily combined with a large number of spectrometric detection techniques such as UV/Vis, fluorescence, and mass spectrometry as well as nonspecific detection techniques such as RI, ELSD, and Corona CAD [2]. HILIC in conjunction with MS detection then allows for the direct determination of very hydrophilic or polar molecules that do not contain a chromophore in their molecule, such as dimethylamine, lysine or Bis(2-chloroethyl)amine in various pharmaceutical preparations. Several case studies were presented, one example being the determination of dimethylamine in metformin.

HPLC.cz: Den 4 - HILIC v praxi - Řešení výzev farmaceutického vývoje (Michal Douša)

10:40 – 11:00 Aplikace HILIC separací v bioanalýze

• Miroslav Kubát 

Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) je výbornou technikou kapalinové chromatografie (LC) pro separaci polárních a hydrofilních či ionizovatelných sloučenin, které obecně nejsou dobře zadržovány na reverzních fázích (RP). Může se jednat například o biogenní látky, jako jsou aminokyseliny a peptidy, cukry a oligosacharidy, nukleotidy a oligonukleotidy, nebo také polární metabolity různých farmak s glutathionem, cysteinem či kyselinou glukuronovou. Technika HILIC je tedy vhodnou alternativou k RP pro separaci takto polárních látek, které by jinak musely být derivatizovány, ať už za účelem snížení jejich polarity či zavedení chromoforu pro umožnění UV detekce. Ze své podstaty je HILIC ideální technikou pro přímé spojení s hmotnostní spektrometrií (MS). Navíc mnoho polárních látek, jako jsou aminokyseliny, neobsahují žádný chromofor, a tedy velmi špatně absorbují UV záření, naopak přítomnost ionizovatelných funkčních skupin usnadňuje jejich detekci pomocí MS. Komerčně je dostupná široká škála stacionárních fází pro HILIC od holých silikagelových kolon, přes různé modifikace silikagelu a zwitteriony až po hybridní silikagel a polymerní modifikace zvyšující chemickou stabilitu [1].

Jednoduchou aplikací HILIC separace spojené s MS bylo například selektivní stanovení aminokyselin v zrnkách kávy bez nutnosti derivatizace, kdy jsme sledovali vliv doby pražení na obsah jednotlivých aminokyselin. HILIC technika najde své uplatnění také v cílené metabolomice glutathionu a jeho metabolických cyklů. Glutathion je hlavní intracelulární antioxidant, slouží tedy jako indikátor oxidačního stresu a také je biomarkerem mnoha chronických onemocnění, jako jsou diabetes mellitus, cystická fibróza, osteoartritida, onemocnění ledvin a jater, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění. Dále je indikátorem také akutních otrav např. paracetamolem či těžkými kovy, jelikož se podílí na jejich detoxifikaci [2]. Technika HILIC – MS/MS nám umožňuje monitorovat nejen glutathion, ale také celý jeho metabolismus v buněčných kulturách, které byly vystaveny působení toxinů či těžkých kovů. Hlubší porozumění metabolismu glutathionu může vést k efektivnější terapii při intoxikacích a teoreticky také ke zmírnění symptomů zmíněných chronických onemocnění.

HPLC.cz: Den 4 - Aplikace HILIC separací v bioanalýze (Miroslav Kubát)

11:10 – 11:20 ZÁVĚREČNÁ PŘEDNÁŠKA

• Lucie Nováková

HPLC.cz: Den 4 - ZÁVĚREČNÁ PŘEDNÁŠKA (Lucie Nováková)

Výsledky soutěže o nejlepší plakátové sdělení

• 1. místo - Martin Novák

HPLC.cz: Den 4 - Vyhodnoceno nejlepší plakátové sdělení - 1. místo (Martin Novák)

• 2. místo - Michal Kaleta

HPLC.cz: Den 4 - Vyhodnoceno nejlepší plakátové sdělení - 2. místo (Michal Kaleta)

• 3. místo - Viktória Ďurčová

HPLC.cz: Den 4 - Vyhodnoceno nejlepší plakátové sdělení - 3. místo (Viktórie Ďurčová)

Partneři a sponzoři konference

HPLC.cz: Partneři a sponzoři konference - Watrex Praha

HPLC.cz:Modern HPLC separations in theory and practice

HPLC.cz: Partneři a sponzoři konference - Česká chromatografická škola