Vitatox 2021 - Den 3

Třetí, závěrečný den letošní konference VITATOX byl věnován především analýzám rostlinného materiálu, ovoci a jeho vlivu na lidský organizmus. První blok byl zahájen problematikou transdermální absorpce chemických látek na vzorku prasečí kůže. Následovala problematika významu kyseliny listové v těhotenství nebo během kojení, která, jak data ukazují, důležitou pro zdravý vývoj a především prevenci vývojových vad dětí. Poslední 2 přednášky se pak zaměřili na využití kapalinové chromatografie (HPLC) ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS) s vysokým rozlišením (UHPLC-TOF-MS) pro studium metabolitů rostlin a biologicky aktivních látek, která vyžaduje citlivou analytickou metodu a rychlou separaci jednotlivých složek.

Druhý a zároveň závěrečný blok se podíval na ovocné stromy jako na bohatý zdroj fenolických látek (listy, kůra, pupeny, květy) a změny v jejich zastoupení v čase. Možnosti LC/MS systémů na bázi Orbitrap Exactive při analýze pesticidů v komplexních matricích byly náplní druhé přednášky. Co se děje s reziduí pesticidů v průběhu skladování ovoce nám objasnily data z třetí přednášky. Jak detekovat uremické toxiny, které se akumulují v těle pacientů s renálním selháváním a jejichž eliminace klasickou dialýzou je velmi obtížná jsme viděli v předposlední přednášce za kterou již následovala přednáška poslední. Ta nám ukázala, jak může být složení lidské moče skvělým zdrojem informací o našem zdravotním stavu.

Metodika testování transdermální absorpce chemických látek in vitro

• MUDr. Lenka Kotingová, Lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Hradci Králové

Vzhledem k legislativním omezením testů in vivo jsou k testování transdermální absorpce látek čím dál častěji používány metody in vitro. Pro jejich provádění existuje mnoho doporučení různých autorit (WHO, OECD, EFSA), chybí však konkrétní postupy daných metod. Proto jsme se rozhodli pro použití v laboratořích VÚOS Rybitví vyvinout certifikovanou metodiku umožňující identifikaci transdermálního přenosu chemických látek in vitro jako součást testování dermální toxicity. Tyto metodiky budou po certifikaci (validování v systému SLP – Správná laboratorní praxe) standartně nabízeny v rámci komplexní testovací baterie pro oblast dermální toxicity.

Vyvíjeny jsou dvě metody lišící se typem testované látky (radiačně značená a neznačená). Metodika využívající radiačně značené látky byla certifikována v roce 2021, metodika používající radiačně neznačené látky bude certifikována v roce 2022. V průběhu experimentů byly používány statické vertikální difúzní komůrky (Franz cells) a hodnoceny tři typy testovaných látek - kofein (jako model hydrofiní látky, KO/W = 0,07), benzoová kyselina (log KO/W = 1,87) a testosteron (model lipofilní látky, log KO/W = 3,32). Jako penetrační membrána byly hodnoceny lidská a prasečí kůže a uměle vytvořené membrány (Strat-M, Xe-derma). Byly hodnoceny různé typy předtestové kontroly kvality kůže, vliv zmražení na kvalitu kůže, časová schémata odběru a způsob odběru receptorové tekutiny. K analýze receptorové tekutiny byly použity dvě metody – pomocí scintilačního přístroje (Beckman Coulter LS 6500) při testování radiačně značených chemických látek a HPLC analýza (přístroj Shimadzu Nexera) v případě použití neznačených látek.

Význam kyseliny listové v těhotenství pro zdravý vývoj a prevenci vývojových vad dětí

• MUDr.Eva Fuchsová, GYNEKOLOGIE s.r.o.,
• RNDr.Milena Bušová,CSc., 1.LF UK a VFN PRAHA

Kyselina listová (vitamin B9) je ve vodě rozpustný vitamin ze skupiny vitaminů B. Má významnou a nezastupitelnou úlohu v metabolismu. Jejími přirozenými zdroji jsou především potraviny typu listové zeleniny, některé druhy ovoce, ořechy, slunečnicová semena, kvasnice aj. Je netoxická, vstřebává se z potravy v tenkém střevě a vzhledem k rozpustnosti se její případný přebytek vyloučí z organismu močí. Její potřeba narůstá hlavně v těhotenství. Kyselina listová sama o sobě nemá metabolický význam, ale slouží v organismu jako výchozí substrát pro tvorbu velmi významných metabolitů folátů, z nichž pro organismus nejvýznamnější je 5-methyltetrahydrofolát (5-MTHF). Foláty jsou nezbytné pro syntézu nukleových kyselin a při krvetvorbě. V prevenci kardiovaskulárních chorob brání hromadění pro organismus nebezpečného homocysteinu, který patří k rizikovým faktorům aterosklerózy. Obzvlášť velký význam mají foláty v těhotenství. Jsou nepostradatelné pro vyvíjející se plod, pro správný růst, vývoj nervové soustavy a v prevenci závažných vývojových poruch dítěte. Je prokázáno, že dostatečné množství folátů v organismu matky v prvním trimestru má preventivní účinek proti předčasnému porodu a potratům, je prevencí vzniku závažných vývojových vad, jako jsou rozštěpy neurální trubice a některé další patologie v těhotenství. Proto je doporučeno již v období před plánovaným otěhotněním dostatečně saturovat organismus kyselinou listovou.

Naše studie je zaměřena na sledování úrovně saturace organismu nastávajících matek sledováním hladiny metabolitu 5-MTHF v moči respondentek. Výsledky analýz jsme doplnili dotazníkem na informovanost nastávajících matek, celkovou životosprávu v období těhotenství, stravovací zvyklosti, příjem ovoce a zeleniny a příjem suplementů s kyselinou listovou.

Sulfatované metabolity rostlin

• Mgr. Klára Supíková, Univerzita Palackého

Neobvyklé kyseliny zosterová, 4-(sulfooxy)benzoová a 4-(sulfooxy)fenyloctová byly objeveny v mořské trávě Zostera marina a v mořské řase Dasycladus verimicularis (Todd et al., 1993; Kurth et al., 2015). V nedávné době jsme potvrdili, že se tyto, a další jim příbuzné látky běžně vyskytují v různých druzích suchozemských rostlin. Pomocí UHPLC-TOF-MS metody a detekce neutrální ztráty SO3 bylo identifikováno několik dosud nepopsaných sulfatovaných fenolických kyselin, např. kyseliny ferulová 4-sulfát a vanilová 4-sulfát, které byly pro potvrzení struktury syntetizovány. Metabolity byly charakterizované pomocí MS/MS spekter, podle kterých lze sulfatované fenolické látky odlišit od další skupiny sulfatovaných sekundárních metabolitů, tzv. glukosinolátů. Ty mají sulfát vázaný na dusíku, zatímco sulfatované fenolické kyseliny mají sulfát vázaný na uhlíku. Díky tomu poskytují glukosinoláty při fragmentaci v kolizní cele produktový ion (H2SO4-H)- (m/z 97), který má u sulfatovaných fenolických látek jen minimální intenzitu. Lokalizace těchto metabolitů v rostlině byla dále studována separací a následnou analýzou symplastu a apoplastu z kořene i nadzemní části ovsa setého. Pomocí exogenní aplikace izotopicky značeného sulfátu (34SO4)2- bylo potvrzeno, že anorganický síran slouží k biosyntéze kyseliny zosterové i 4-(sulfooxy)benzoové. Tato data jsou dále diskutována a analyzována v souvislosti s výskytem neznámých metabolitů obsahujících síru.

Perspektiva neznámých metabolitů rostlin s biologickou aktivitou

• Mgr. Jiří Grúz, PhD., Univerzita Palackého

Moderní necílené LC-MS analýzy ukazují, že rostliny obsahují nespočetné množství metabolitů s neznámou strukturou. Řada z nich potom vykazuje nějakou formu biologické aktivity, což lze demonstrovat vhodným farmakognostickým postupem. Klíčovým problémem bývá identifikace/izolace aktivní složky ze složité směsi. V současnosti objevené aktivní metabolity jsou často přítomny ve velmi nízkých koncentracích nebo vykazují strukturní vlastnosti znesnadňující jejich izolaci a identifikaci. Z historického hlediska je objev přírodních biologicky aktivních látek stále složitější. Efektivní postup pro vyhledávání biologicky aktivních látek v rostlinách tak musí zahrnovat citlivou analytickou metodu a rychlou separaci složek. Vhodným nástrojem pro hledání neznámých biologicky aktivních metabolitů je korelační metabolomika, která mnohonásobně urychluje klasickou frakcionaci řízenou biologickou aktivitou díky jednokrokové separaci extraktu (Rárová et al., 2019). Tato metoda je založena na korelaci biologické aktivity s koncentrací metabolitů v několika částečně separovaných frakcích.

Ovocné stromy jako významný zdroj fenolických látek; sledování změn v průběhu vegetace

• Mgr. Anežka Adamcová, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Cílem dlouhodobého výzkumu je upozornit na bohaté zastoupení fenolických látek v materiálu z ovocných stromů (listy, kůra, pupeny, květy). Sledovanými stromy byly jabloně a hrušně. Pro zjištění měnicího se fenolického profilu během vegetačního období byl odběr proveden v březnu, červnu, srpnu a listopadu v letech 2019 – 2020. Hlavní extrahované fenolické sloučeniny z jabloně (floridzin, floretin, kvercetin a kyselina chlorogenová) a hrušně (arbutin, rutin, kyselina chlorogenová a její deriváty) byly analyzovány dvěma validovanými HPLC metodami s detektorem diodového pole. Pro analýzu byly použity analytické kolony YMCTriart C18 ExRS 150 × 4,6 mm × 5 um, 8 nm (jabloň) a ASCENTIS Express RP-Amide 150 × 4,6 mm × 2,7 μm (hrušeň).

Ve sledovaných stromech byla zjištěna nejvyšší koncentrace fenolických látek v listech v měsíci březen. V tomto jarním období byla koncentrace fenolických látek od 164,25 mg/g - 228,85 mg/g v listech, 48,76 mg/g - 73,01 mg/g v kůře, 96,57 mg/g - 176, 45 mg/g v pupenech a 74,91 mg/g - 132,43 mg/g v květech v 10 různých odrůdách jabloní. Koncentrace fenolických sloučenin v 10 odrůdách hrušní byla 85,04 mg/g - 161,69 mg/g v listech, 15,74 mg/g - 40,49 mg/g v kůře, 48,28 mg/g - 71,01 mg/g v pupenech a 45,44 mg/g - 63,43 mg/g v květech. Hlavními fenolickými sloučeninami byly phloridzin (jabloně) a arbutin s kyselinou chlorogenovou (hrušně).

Materiál z ovocných stromů představuje doposud nevyužívaný zemědělský materiál. V rámci výzkumu byla zjištěna i antimikrobiální aktivita extraktů z listí. Výzkum tak poukazuje na možnost znovuvyužití tohoto materiálu s uplatněním v kosmetickém, farmaceutickém či potravinářském průmyslu.

Výhody a limitace orbitální pasti v problematice detekce a kvantifikace pesticidů v rostlinném a jiném materiálu

• PharmDr. Viktor Voříšek, FAKULTNÍ NEMOCNICE V HRADCI KRÁLOVÉ

Neustálý růst zemědělské produkce potravin je neodmyslitelně spojen s nutným užíváním pesticidů. Jejich efektivní analýza v nejrůznějších materiálech – částech rostlin, zemině nebo i v tělech hmyzích opylovačů je klíčovou pro nastavení bezpečné usance takových látek v zemědělských ekosystémech. Míra efektivity použitého analytického systému pro tento účel spočívá ve schopnosti zachytit zástupce této obrovské skupiny mnoha chemických tříd zpravidla ve stopových množstvích jejich residuí (ppb). Pokud jde o využití hmotnostního spektrometru na principu orbitální iontové pasti, mohli jsme se přesvědčit, že i necílená analýza pesticidů je poměrně snadná s tím, že pro konfirmační analýzy je možno využít několik nabízených skenovacích modů typických pro systémy Exactive (Thermo Fisher Scientific) s tím, že v drtivé většině případů jsme si vystačili se základním plným skenem přesné hmoty (full scan mode).

K izolaci pesticidů z rostlinného a dalšího materiálu, viz výše, využíváme dnes již klasickou nízkonákladovou extrakční techniku disperzní SPE (extrakce na pevné fázi) – QuEChERS, kterou si však optimalizujeme s ohledem na maximální výtěžnost při dodržení rentability metody. Následně byl pro rychlý screening pesticidových residuí zvolen systém Exactive Focus ve spojení s ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií umožňující rychlou a silnou gradientovou separaci na oktadecylové koloně s vodně-organickou mobilní fází (0.1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu s malým přídavkem methanolu, resp. vodě) s vysokorozlišovací hmotnostní detekcí s převážně pozitivní elektrosprejovou ionizací v plném nebo PRM (parallel reaction monitoring) skenu.

Využití dlouhodobého skladování s ohledem na degradaci reziduí pesticidů v ovoci

• RNDr. Aneta Bílková, VSÚO Holovousy

Pesticidy a jejich rezidua patří k široké škále látek, které mohou kontaminovat potraviny. Byla sledována kinetika degradací vybraných reziduí u čerstvých a skladovaných plodů třešní s využitím technologie dlouhodobého skladování (obaly s modifikovanou atmosférou, skladování v atmosféře s nízkou hladinou kyslíku, posklizňové ošetření 1-methylcyklopropenem a ozon). Kombinace účinných látek zahrnující acetamiprid, boscalid, cyprodinil, fenhexamid, fenpyrazamin, fludioxonil, fluopyram, pyraclostrobin, pirimicarb, tebuconazole, thiacloprid a trifloxystrobin byly monitorovány a hodnoty reziduí byly podle doporučené aplikace nalezeny hluboko pod maximálním limitem reziduí pesticidů. Nízký obsah acetamipridu, boscalidu, fenpyrazaminu, thiaclopridu, pirimicarbu a fludioxonilu byl stanoven v plodech skladovaném v obalech s modifikovanou atmosférou, statisticky významné množství bylo pozorováno pouze u fludioxonilu. Ozon měl účinek na degradaci tebuconazolu, pyraclostrobinu a cyprodinilu. Obdobné výsledky byly získány pro plody ošetřené 1-methylcyklopropenem a plody skladované při ultranízké hladině kyslíku. Byla pozorována korelace mezi skladováním a degradací pesticidů. Boscalid, trifloxystrobin a fenhexamid byly účinnými látkami nejstabilnějšími za těchto skladovacích podmínek během 42 dnů skladování. Naopak nejméně stabilními látkami byly cyprodinil, thiacloprid, tebuconazol a pyraclostrobin.

Stanovení uremických toxinů

• Ing. Jana Volková, VÚOS, Ing. Kristýna Krchová, Fakultní nemocnice Hradec Králové

Uremické toxiny představují heterogenní skupinu látek, které se akumulují v těle pacientů s renálním selháváním. Významnou skupinu látek tvoří uremické toxiny vázané na protein, jejichž eliminace klasickou dialýzou je velmi obtížná. Nejvýznamnějším toxinem ze skupiny těchto látek je indoxyl sulfát, který vzniká fermentací tryptofanu v tlustém střevě. Koncentrace indoxyl sulfátu v krvi dialyzovaných pacientů je řádově vyšší než u zdravých osob. Hlavním cílem projektu je vyvinout dostupnou a efektivní metodu pro stanovení koncentrace indoxyl sulfátu v peritoneálním dialyzátu a v krevním séru. Tato metoda bude představovat možnost monitorovat dialyzované pacienty a zlepšovat péči o pacienty s diagnózou renálního selhávání.

V současné době stále probíhá vývoj a optimalizace spektrofotometrických a chromatografických metod. Pro stanovení indoxyl sulfátu je testováno několik technik a postupů předúpravy vzorků. Chromatografická metoda pro stanovení indoxyl sulfátu v krevním séru byla již vyvinuta a akreditována.

Tajemství lidské moči

• doc. Ing. Aleš Horna, CSc., RADANAL

Lidská moč je obecně chápána jako směs odpadních látek, kterých se lidský organismus zbavuje. Složení lidské moče však může poskytovat informace o zdravotním stavu lidského organismu, jeho dietě a vlivu životního a pracovního prostředí. V naši laboratoři byla vyvinuta metoda měření antioxidační aktivity z využitím průtokové injekční analýzy ve spojení s coulochemickou detekcí. Tato metoda byla úspěšně aplikována pro hodnocení tisíce vzorků jak ovoce, tak extraktů z bylin, listí a kůry stromů, vína, piva atd. V letošním roce jsme se začali věnovat aplikaci této metody pro hodnocení antioxidační aktivity moče v souvislosti s vlivem stravy na lidské zdraví.

Ačkoliv to může být úsměvné, na základě našich dlouhodobých experimentů s antioxidanty z různých přírodních zdrojů, můžeme konstatovat, že lidská moč z hlediska antioxidační aktivity je srovnatelná s dobrým červeným vínem.

Vitatox 2021: Tajemství lidské moči (doc. Ing. Aleš Horna, CSc.)