HYBRID LC-MS/MS FOR QUANTIFICATION OF INFLIXIMAB IN CROHN’S DISEASE PATIENT SAMPLES: DOES IT ADD VALUE?

Význam tématu

Therapeutické monitorování hladin anti-TNF bioterapeutika infliximabu je klíčové pro optimalizaci léčby Crohnovy choroby. Variabilita výsledků mezi komerčními ELISA sadami znesnadňuje rozhodování v klinické praxi. Hybridní LC-MS/MS metody slibují vyšší specifitu a robustnost měření aktivní (volné) látky ve srovnání s tradičními ELISA přístupy.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává tři analytické postupy pro kvantifikaci infliximabu v séru pacientů s Crohnovou chorobou (N=89):

• ELISA (LISA TRACKER), měření volné formy použitím TNF-α mikrotitračního testu
• Direct digestion LC-MS/MS, celkové množství léku po proteolytické štěpení
• Hybridní (imunoadsorpční) LC-MS/MS, využití biotinylovaného TNF-α pro izolaci volného infliximabu před LC-MS/MS

Hlavním cílem bylo vyhodnotit přesnost, linearitu a schopnost klasifikovat pacienty podle terapeutických prahů subterapeutická, intermediární a terapeutická hladina.

Použitá instrumentace

Pro LC-MS/MS byla využita sestava:

• Acquity I-Class UPLC PLUS (Waters)
• Xevo TQ-XS tandemový kvadrupól s ESI+ (Waters)
• Kolona BEH C18 1,7 μm, 2,1 x 150 mm
• ProteinWorks eXpress Digest Kit pro přípravu vzorků
• Straťtok magnetické kuličky se streptavidinem pro hybridní postup

Použitá metodika

Vzorky séra byly rozděleny do 3 postupů:

• ELISA LT: vzorky inkubovány v TNF-α povlečených ploškách, detekce barvou TMB
• Direct Digestion LC-MS/MS: 25 μl séra ředěného digestačním pufrem, proteinová srážka, tryptická štěpení, SPE čistění, analýza vybraných peptidů
• Hybrid LC-MS/MS: 5 μl séra, imunoadsorpce volného infliximabu na biotinylovaný TNF-α, eluce kyselinou, tryptické štěpení, analýza LC-MS/MS

Hlavní výsledky a diskuse

Oba LC-MS/MS přístupy vykázaly výbornou lineární kalibraci (r2>0,99) v rozsazích vhodných pro klinické měření. Porovnání s ELISA:

• Hybrid vs ELISA: průměrný bias +47 %, vyšší citlivost na specifické peptidy
• Direct digestion vs ELISA: průměrný bias +23,4 %
• Hybrid vs Direct digestion: průměrný bias –14,9 %

Peptid SINSATHYAESVK vykazoval známky in vivo deamidace a byl v hybridní analýze vyloučen. Druhé peptidy vykázaly stabilní a lineární odezvu.
Klasifikace pacientů do hladin subterapeutická (<1,0 μg/ml), intermediární (1,0–2,0 μg/ml), terapeutická (>2,0 μg/ml) dosáhla v případě terapeutické hladiny ~90% shody mezi všemi metodami, celková shoda pro všechny hladiny byla ~60 %.

Přínosy a praktické využití metody

Hybridní LC-MS/MS přináší větší analytickou specifitu díky selekci volného infliximabu antigenní vazbou, což minimalizuje interference a zvyšuje důvěru v kvantitativní výsledky. Direct digestion přístup nabízí jednoduché provedení a měření celkového množství léku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj LC-MS/MS metodiky může zahrnovat:

• Současné sledování protilátek proti léku
• Optimalizované klasifikační prahy přizpůsobené LC-MS/MS
• Multiplexní měření dalších bioterapeutik v jednom běhu

Závěr

Byly vyvinuty a validovány dva přístupy LC-MS/MS pro kvantifikaci infliximabu u pacientů s Crohnovou chorobou. Oba vykazují výbornou linearitu a klinickou použitelnost, přičemž hybridní metoda zvyšuje specifitu a shodu s terapeutickými rozhodnutími ve srovnání s ELISA.

Reference

1. Dunning CM, Lame ME. Development of a Hybrid Immunoaffinity-LC-MS/MS Method for the Quantification of Active Biotherapeutic Targeting TNF-α in Serum. 2018. 720006317EN.
2. Samaan MA, Arkir Z, Ahmad T, Irving PM. Wide variation in the use and understanding of therapeutic drug monitoring for anti-TNF agents in inflammatory bowel disease: an inexact science? Expert Opinion on Biological Therapy. 2018;18(12):1271–1279.
3. National Institute for Health and Care Excellence. Therapeutic monitoring of TNF-alpha inhibitors in Crohn's disease (DG22). 2016.