Improving LC-MS Separations of Peptides with Difluoroacetic Acid Ion Pairing

Význam tématu

Peptidové mapování je zásadní pro charakterizaci bioterapeutik, kde se využívá kapalinová chromatografie v reverzní fázi spojená s hmotnostní spektrometrií (RPLC-MS).
Konvenční iontové párování formiovou nebo trifluoroctovou kyselinou představuje kompromis mezi chromatografickým rozlišením a citlivostí v MS. Difluoroctová kyselina (DFA) nabízí alternativu s nižšími protonačními vlastnostmi a redukovaným potlačením signálu v MS.

Cíle a přehled studie

Tato studie porovnala účinnost 0,1 % FA, DFA a TFA jako mobilních fází při separaci trypticky digesto­vaných peptidů NIST mAb standardu na dvou typech C18 kolonek (BEH a CSH). Cílem bylo vyhodnotit chromatografickou selektivitu, špičkovou kapacitu a kvalitu MS dat včetně aduktů kovů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza byla provedena na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio s TUV detektorem a Xevo G2-XS QToF MS.
Kolony: ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 a Peptide CSH C18 (1,7 µm, 130 Å, 2,1×150 mm) při 80 °C.
Mobilní fáze obsahovala 0,1 % FA, DFA nebo TFA v H2O (A) a v acetonitrilu (B) s gradientem dle tabulky.
MS parametry: full scan 100–2000 m/z, cone 50 V, desolvace 500 °C, fragmentace 20–40 V.

Hlavní výsledky a diskuse

DFA poskytla jedinečnou selektivitu separace, s peak capacity blízko hodnotám dosaženým s TFA, avšak s výrazně lepší citlivostí než u TFA a pouze mírně nižší než u FA.
Čistota DFA certifikovaná na nízký obsah sodíku a draslíku vedla k významnému snížení kovových aduktů v spektru a klesající spectral crowding.
Charge state distribuce u DFA byla mezi FA a TFA, což naznačuje optimalizovaný kompromis ionizace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda s DFA kombinuje vysokou chromatografickou kapacitu a dobrou citlivost v MS, vhodná je pro vysoce citlivé peptidové mapování v oblasti biopharma.
Certifikovaný IonHance DFA v kombinaci s polymerními kontejnery minimalizuje kontaminaci kovovými ionty a zvyšuje reprodukovatelnost MS dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší využití DFA nejen pro peptidové, ale i subunitní a intact protein analýzy.
Vývoj nových iontových párů a úpravy povrchových vlastností kolonek mohou dále zlepšit selektivitu a citlivost.
Minimalizace kontaminace kovovými ionty zůstává klíčová pro špičkové MS aplikace.

Závěr

Difluoroctová kyselina představuje vyvážený kompromis mezi formiovou a trifluoroctovou kyselinou, nabízí vysokou peak capacity i citlivost v MS a snižuje kovové adukty.
IonHance DFA doporučeno pro kvalitní LC-MS peptidové analýzy v bioterapeutickém vývoji a kontrole kvality.

Reference

• Manuscript in review.
• Kellett J., Birdsall R. a Yu Y. Application of Difluoroacetic Acid to Improve Optical and MS Performance in Peptide LC-UV/MS. Waters Technical Brief, PN: 720006482EN (2018).
• Nguyen J. M., Liu X. a Lauber M. A. Low Adduct Peptide LC-MS Obtained with IonHance DFA and Certified LDPE Containers. Waters Application Note, PN: 720006596EN (2019).