Factors Affecting the Compatibility of Reversed-Phase Chromatographic Materials with Highly Aqueous Mobile Phases

Význam tématu

Ačkoli je reverzní fázová kapalinová chromatografie široce využívaná pro svou reprodukovatelnost a univerzálnost, separace vysoce polárních analytů představuje významnou výzvu. Při použití mobilních fází s vysokým podílem vody dochází k částečnému či úplnému dewettingu (vysychání) částic stacionární fáze, což vede k poklesu retence a reproducibility. Zlepšení kompatibility materiálů s 100% vodnými fázemi je zásadní pro analýzu biologicky aktivních substancí, metabolitů a jiných polárních látek v farmaceutickém i průmyslovém sektoru.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat vliv:

• pórovité struktury (průměr póru),
• povrchové koncentrace C18 ligandů,
• přítomnosti kladného povrchového modifikátoru

na retenci a stabilitu kapalinové chromatografie při 100% vodních mobilních fázích a po přerušení průtoku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro měření retence byl použit systém ACQUITY UPLC I-Class vybaven detektorem Photodiode Array (254 nm). Kolony o rozměru 2,1 × 50 mm a částicích 1,7 μm byly temperovány na 30 °C. Jako mobilní fáze sloužila 100% vodná suspenze 10 mM formiátu amonného (pH 3) při průtoku 0,2 mL/min. Sledovaly se retence směsi modelových polárních analytů (thiourea, 5-fluorouracil, nikotinamid, procainamid, adenosin-5′-monofosfát, resorcinol).

Hlavní výsledky a diskuse

1) Vliv průměru póru:

• Materiály BEH s póry od 138 Å do 66 Å vykazovaly rostoucí ztrátu retence menších pórových průměrů.
• Kolona s 138 Å vykázala pouhých ~4% ztrátu retence uracilu po zastavení a znovuspouštění průtoku, zatímco 66 Å materiál ztratil ~9,2 %.

2) Vliv povrchové koncentrace C18 a kladného modifikátoru:

• Testovány byly povrchové koncentrace C18 mezi 1,4–1,8 µmol/m2 a nízké až vysoké koncentrace modifikátoru.
• Nejlepší retenci a minimální dewetting (~1,9–4,3 % ztráty retence) dosáhla kombinace střední koncentrace C18 (1,6 µmol/m2) s vysokou koncentrací kladného modifikátoru na materiálu BEH95 RP/AX.

Výsledky ukazují, že větší póry zajišťují lepší pronikání vodné fáze a že přídavek povrchově aktivního pozitivního modifikátoru významně zlepšuje stabilitu mokrého stavu stacionární fáze.

Přínosy a praktické využití metody

• Zachování vysoké retence polárních analytů při 100% vodných fázích.
• Zvýšená reprodukovatelnost analýz i po přerušení průtoku, což je klíčové pro automatizovaná či dávková měření.
• Možnost nasazení v QA/QC laboratořích a farmaceutickém vývoji pro spolehlivou kvantifikaci polárních sloučenin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj dalších speciálních modifikátorů pro optimalizaci mokrého stavu různých typů materiálů.
• Aplikace v multidimenzionální chromatografii pro složité biologické matice.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro zvýšení selektivity a citlivosti ve stopových koncentracích.

Závěr

Studie potvrdila, že klíčovými faktory pro kompatibilitu reverzní fáze s vysoce vodnými mobilními fázemi jsou velikost pórů, povrchová koncentrace C18 ligandů a přítomnost kladného povrchového modifikátoru. Optimální kombinace těchto parametrů na materiálu BEH95 RP/AX umožnila provoz v 100% vodě s minimální ztrátou retence polárních analytů.

Reference

1. T. H. Walter, P. Iraneta a M. Capparella J. Chrom. A 1075, 2005, 177.
2. F. Gritti, D. Brousmiche, M. Gilar, T. H. Walter a K. Wyndham J. Chrom. A 1596, 2019, 41.