EVALUATION OF NEW MS-COMPATIBLE MIXED-MODE RP/AX HPLC COLUMNS

Význam tématu

Separace polárních a ionizovatelných sloučenin je klíčová pro farmaceutický výzkum, metabolomiku a kontrolu kvality, zejména při analýze kyselých a fosfátových derivátů, které bývají v klasické RP chromatografii špatně zadržovány. Zároveň je nezbytné, aby metoda byla kompatibilní s hmotnostní spektrometrií (MS) a minimalizovala adsorpci na kovové povrchy kolony.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo navrhnout a vyhodnotit novou řadu mixed-mode RP/anion-exchange kolon s vysokou fází-ratio BEH částicemi, označenou Atlantis PREMIER BEH C18 AX. Autoři porovnali chromatografické vlastnosti a reprodukovatelnost nové fáze s komerčně dostupnými materiály (HSS T3, CSH C18), analyzovali retenci polárních sloučenin, stabilitu v širokém pH rozsahu a vliv na MS detekci.

Použitá metodika a instrumentace

Byly provedeny izokratické a gradientní separace modelové směsi šesti polárních analytů a organických kyselin. Použité systémy:

• UPLC ACQUITY I-Class s PDA detektorem pro UV měření při 254 nm
• UPLC ACQUITY H-Class s Xevo TQD-MS pro ESI-MS měření

Podmínky separace:

• Kolony Atlantis PREMIER BEH C18 AX (2.1×50 mm a 2.1×150 mm, částice 1.7 µm)
• Mobilní fáze: 10 mM formiát amonný, pH 3.00 (akva) a acetonitril/formiátová směs pro MS
• Teplota kolony 30–50 °C, průtok 0.2 mL/min, injekční objem 1.5 µL
• Hardware MaxPeak HPS pro minimalizaci adsorpce kovových povrchů

Hlavní výsledky a diskuse

Nová AX-RP fáze založená na 95 Å BEH částicích vykazuje díky vyšší povrchové ploše (270 m2/g) a pozitivně nabitému alkylaminovému modifikátoru následující vlastnosti:

• Silnější retence aniontů (např. AMP) a snížená retence kationtů ve srovnání s HSS T3 a CSH C18
• Výborná reprodukovatelnost retencí (RSD 1–3 % mezi 27 šaržemi)
• Stabilita v širokém pH rozsahu 2–10 při zachování účinnosti separace
• Minimální matrix effect v ESI-MS (< dalších dvou vedoucích mixed-mode fází) v obou módech ESI
• MaxPeak HPS hardware zvyšuje MS signál pro fosfátové analyty až 19× a zlepšuje tvar špiček
• Účinná separace nízkomolekulárních organických kyselin v 20 ppm standardech i v reálném vzorku pomerančového džusu

Přínosy a praktické využití metody

Atlantis PREMIER BEH C18 AX nabízí:

• Zvýšenou selektivitu pro ionizované kyseliny bez potřeby iontové páry
• Široký pracovní pH rozsah umožňující flexibilní úpravu selektivity
• Kompatibilitu s MS detekcí a nízkou úrovní iontového potlačení
• Robustní hardware minimalizující adsorpci na kovové povrchy
• Vysokou reprodukovatelnost mezi výrobními šaržemi

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování a aplikace mixed-mode RP/AX kolon zahrnuje:

• Optimalizaci pro širokou škálu biomolekul (fosforylované peptidy, nukleové kyseliny)
• Integraci s vysoce výkonnými hmotnostními spektrometry nové generace
• Využití v online multidimenzionálním uspořádání pro komplexní metabolomické a proteomické studie
• Vývoj povrchových modifikací pro cílenou separaci ionogenních léčiv a jejich metabolitů

Závěr

Atlantis PREMIER BEH C18 AX mixed-mode kolony spojují výhody reversed-phase a anion-exchange separace s vysokou pH stabilitou a MS kompatibilitou, což umožňuje efektivní, reprodukovatelné a selektivní analýzy polárních a ionizovatelných látek v různorodých aplikacích.