New Reversed-Phase Materials for the Separation of Polar Acidic Compounds

Význam tématu

Reverzní fázová kapalinová chromatografie (RP-LC) je standardem pro analýzu neutrálních i ionizovatelných sloučenin. Silně polární a kyselé metabolity však trpí nedostatečnou retencí na konvenčních RP stacionárních fázích. Vyvinutí materiálů, které podporují vysokou retenci polárních kyselin při současné kompatibilitě s vysoce vodnými mobilními fázemi a citlivou detekcí, představuje klíčový krok pro biochemické a klinické aplikace, zejména pro analýzu metabolitů TCA cyklu či nukleotidů bez nutnosti organické modifikace vzorku nebo derivatizace.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na přípravu a charakterizaci nových reverzněfázových materiálů založených na částicích BEH s různou velikostí pórů (66–138 Å) a s kombinovanou C18/aniontovou (RP/AX) modifikací. Cílem bylo:

• hodnotit vliv velikosti pórů na retenci polárního modelu (thyminu),
• ověřit kompatibilitu s 100% vodnými mobilními fázemi,
• optimalizovat retenci šesti modelových analy­tů (kyselých i zásaditých) změnou pH a koncentrace pufrů,
• srovnat nové materiály s komerčními BEH C18 a CSH C18 kolonkami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro měření zvýšení retence a dewetting byly použity dvě UPLC aparatury Waters:

• ACQUITY UPLC I-Class s PDA detektorem (UV 230/254 nm), kolona 2.1×50 mm; průtok 200 µL/min, 30 °C.
• ACQUITY H-Class PLUS s PDA detektorem pro studi­um vlivu pH a koncentrace pufru.

Mobilní fáze obsahovala 10–20 mM formiátu amonného v rozsahu pH 2.5 až 8.5. Jako void marker se používala thiourea.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Velikost pórů a retence:

• Částice BEH s póry 95 Å dosáhly výrazně vyššího retenčního faktoru pro thymine (k ≈9.2) než kontrolní 130 Å (k ≈4.1) či menší 66/79 Å části­ce.
• RP/AX modifikace podporuje vyšší retenci v 100% vodných mobilech díky pozitivnímu povrchu interagujícímu s kyselými analyty.

2) Vliv koncentrace pufru a pH:

• Zvýšení koncentrace formiátu amonného z 5 na 20 mM při pH 3 zlepšilo retenci kyselých sloučenin až o 30 %.
• Optimum retence kyselých metabolitů bylo pozorováno při pH 3.0–5.0, kde je sít’ pozitivně nabitý a posiluje interakci s anionty.
• Retence zásaditých ligandů (např. procainamid) se snižuje vlivem elektrostatického odpuzování.

3) Porovnání materiálů:

• BEH95 RP/AX překonala BEH C18 i CSH C18 v retenci kyselých modelů, zatímco u neutrálních a zásaditých sloučenin neubylo selektivity.

Přínosy a praktické využití metody

Nový materiál BEH95 RP/AX umožňuje:

• citlivou analýzu polárních kyselin v biologických matricích bez derivatizace,
• jednoduchou isokratickou separaci s vysokým podílem vody,
• kompatibilitu s MS detekcí díky vyhnutí se iontově-párovým činidlům,
• optimalizaci selektivity změnou pH a pufru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směřování vývoje stacionárních fází zahrnuje:

• dálší úpravy povrchových nábojů pro jemné ladění retence ionizovatelných látek,
• kombinace RP a iontově-výměnných mechanismů v jednom materiálu,
• vylepšené biofarmaceutické a metabolomické aplikace,
• automatizované platformy pro vysokopropustné testování s odstupňovanou řadou pórů.

Závěr

Studie prokázala, že částice BEH s póry 95 Å a přidáním kladného modifikátoru významně zvyšují retenci polárních kyselých sloučenin při zachování kompatibility s vysoce vodnou mobilní fází. Tento materiál nabízí robustní a MS-přátelskou alternativu k tradičním RP kolonkám pro pokročilé biochemické a klinické analýzy.

Reference

1. Smith K. S., Plumb R. S., Rainville P. D. Separation and Detection of TCA Cycle Metabolites and Related Compounds in Human Urine by UPLC-MS/MS for Clinical Research. Waters Technical Brief 720006463EN, 2019.
2. Walter T. H., Iraneta P., Capparella M. Characterization of Ethyl-Bridged Hybrid Particles. J. Chrom. A 1075 (2005) 177–184.
3. Wyndham K. D. et al. Evaluation of C18 HPLC Stationary Phases Based on Ethyl-Bridged Hybrid Particles. Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788.