AN EFFICIENT LC-MS WORKFLOW FOR IDENTIFICATION AND MONITORING OF HOST CELL PROTEINS FOR ASSISTING MONOCLONAL ANTIBODY PURIFICATION

Význam tématu

Analýza HCP je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti monoklonálních protilátek, protože reziduální bílkoviny hostitelských buněk mohou ovlivnit stabilitu a imunodostupnost bioproduktů.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje dvoufázový LC-MS workflow pro identifikaci a monitoring HCP během purifikace mAb. První fáze (Discovery Assay) využívá datově nezávislou akvizici MSE s 90min separací peptidů pro zjištění neznámých HCP a vytvoření spektrální knihovny. Druhá fáze (Monitoring Assay) zkracuje gradient na 30 min pro rychlou kvantifikaci vybraných HCP. Workflow bylo testováno na NIST mAb a dalších pěti mAb preparátech s použitím čtyř protokolů SCX purifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Digestion NIST mAb Lys-C a trypsinem, odstranění nestrávené mAb, denaturace RapiGestem, redukce DTT, alkylace IAM.
• Spiking standardů MassPREP (ADH, PHO, BSA) v různých koncentracích.

Chromatografie a hmotnostní spektrometrie:

• ACQUITY UPLC I-Class Plus se CSH C18 kolónou (2.1×150 mm, 1.7 µm), gradient 0–45 % B (0.1 % FA/ACN) ve 90 min pro Discovery, 30 min pro Monitoring, tok 0.2 mL/min, 60 °C.
• Xevo G2-XS QTof ve MSE režimu (low-energy CE 4 eV, high-energy ramp 15–45 V), rozsah 100–2000 Da, skeny 0.5 s/0.3 s.
• Software UNIFI 1.9.4 pro akvizici, Progenesis QI for proteomics 4.2 pro zpracování a vytváření spektrální knihovny.

Hlavní výsledky a diskuse

Discovery Assay identifikovala 6 HCP v NIST mAb s detekčním limitem 5 ppm a tři spiked proteiny. Monitoring Assay prokázala vysokou reprodukovatelnost (RSD <10 %) a umožnila sledovat HCP1 a HCP2 v pěti mAb preparátech. SCX protokol D poskytl nejlepší clearance nízkoúrovňových HCP.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí citlivé sledování clearance jednotlivých HCP, vysokou propustnost díky zkráceným běhům a možnost komplexní proteomové i cílené analýzy během vývoje bioprocesu a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření spektrálních knihoven o další HCP, automatizace workflow, integrace s ortogonálními technikami (ELISA, CE-MS) a využití AI pro predikci čistoty a optimalizaci procesů.

Závěr

1D LC-MS platforma s MSE akvizicí poskytuje robustní, citlivý a vysoce průchozí nástroj pro identifikaci a kvantifikaci HCP v procesu výroby mAb, vhodný pro R&D a QA/QC v biotechnologii.

Reference

1. Doneanu et al. Anal Chem, 2015, 87, 10283.
2. Huang et al. Anal Chem, 2017, 89, 5436.