An Efficient LC/MS Workflow for Identification and Monitoring of Host Cell Proteins for Assisting Monoclonal Antibody Process Development

Význam tématu

Host cell proteins (HCP) jsou stopové nečistoty vznikající při výrobě monoklonálních protilátek. I velmi nízké hladiny (0,1–100 ppm) mohou ovlivnit bezpečnost, imunogenicitu a stabilitu bioterapeutik. Regulátoři proto požadují přesné stanovení a kontrolu HCP během vývoje a výroby.

Cíle a přehled studie

Tato studie představuje dva komplementární workflow pro analýzu HCP pomocí LC-MS:

• HCP Discovery – neznámé proteiny identifikované pomocí datově nezávislého snímání (MSE) na Xevo G3 QTof a rozsáhlé 90min gradientní separace.
• HCP Monitoring – cílené sledování známých HCP na platformě BioAccord UPLC-MS s 30min gradientem a zjednodušeným softwarem waters_connect.

Použitá instrumentace

• UPLC: ACQUITY Premier CSH C18 2,1×150 mm, 1,7 μm, 60 °C, 200 μL/min
• Mass spectrometry: Xevo G3 QTof pro Discovery, BioAccord LC-MS pro Monitoring
• Software: Progenesis QI for Proteomics, Byonic, waters_connect, UNIFI

Použitá metodika

Procesní protokol zahrnoval:

• Odstranění převládající monoklonální protilátky modifikovanou srážkovou a digesční metodou s RapiZyme trypsinem.
• Spiking standardních proteinových směsí (MIX-4, MIX-5) do NIST mAb pro evaluaci detekčního limitu.
• Datově nezávislé MSE akvizice: nízkoenergetické a vysokoenergetické fragmentace pro proteomickou identifikaci.
• Gradientní separace: 90 min pro Discovery, 30 min pro Monitoring.

Hlavní výsledky a diskuse

• Discovery workflow identifikoval v NIST mAb nízkomolekulární HCP až do úrovně ~5 ppm, celkem 7 endogenních proteinů (např. aldoláza, adenylát kináza).
• Výsledky byly ověřeny dvěma vyhledávacími nástroji (Progenesis QIP, Byonic) a kvantifikovány metodou Hi3.
• Monitoring workflow na BioAccordu sledoval 43 peptidů z pěti standardních proteinů a prokázal citlivost do 5 ppm při vyšší propustnosti (20–50 vzorků).
• Software waters_connect umožňuje v souladu s regulačními požadavky rutinní kvantifikaci a monitorování ve výrobním prostředí.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní přehled HCP ve vývojové fázi umožňuje přesné mapování kontaminant.
• Rutinní monitoring cílených peptidů zjednodušuje kontrolu kvality v GMP laboratořích.
• Metody lze aplikovat na různé biorežimy a purifikační protokoly pro optimalizaci procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace iontové mobility pro zlepšení separace a vyšší citlivost.
• Rozšíření na kvantitativní paralelní reakcní monitoring (PRM/SRM) pro specifické HCP biomarkery.
• Vývoj datově inteligentních řešení a cloud-based platform pro automatizovanou analýzu a reporting.

Závěr

Dva validované LC-MS přístupy pro analýzu HCP kombinují hlubokou proteomickou identifikaci s vysokou propustností cíleného monitoringu. Obě metody dosahují detekčního limitu ~5 ppm a splňují regulační požadavky pro vývoj i rutinní kontrolu monoklonálních protilátek.

Reference

• Doneanu CE a kol. Anal Chem, 2015.
• Huang L. Anal Chem, 2017.
• Chen IH a kol. Anal Chem, 2020.
• Yang F a kol. Anal Chem, 2021.
• Silva JC a kol. Mol Cell Proteomics, 2006.