An Integrated Workflow for Intact and Subunits of Monoclonal Antibody Accurate Mass Measurements

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří k nejrychleji rostoucí třídě biologik vyžadujících přesnou hmotnostní charakterizaci kvůli své velikosti a posttranslačním modifikacím, zejména glykosylaci. Rychlá, reprodukovatelná a vysoce citlivá analýza mAb je klíčová pro vývoj a kontrolu bioterapeutik a biosimilárů.

Cíle a přehled studie / článku

Tato Application Note demonstruje integrovaný workflow pro automatizované přípravné kroky (imobilizace, čištění, deglykozylace, proteolýza IdeS, redukce) a měření přesné hmotnosti intaktní a subjednotkové formy dvou modelových protilátek (Herceptin a NIST mAb) s využitím platformy Agilent AssayMAP Bravo a LC/Q-TOF.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizace na Agilent AssayMAP Bravo: imobilizace mAb na streptavidinové kazety s biotinylovaným HER2 ECD nebo Protein L, afinitní purifikace z CHO supernatantu, on-cartridge deglykozylace (PNGase F) nebo proteolýza (IdeS), redukce (TCEP) a fractionace elucií (intaktní mAb, glykany, Fc/2, F(ab')2, řetězce).
• UHPLC: Agilent 1290 Infinity II UHPLC se sloupcem PLRP-S (2.1×50 mm, 8 µm).
• MS: Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF s Dual Agilent Jet Stream zdrojem, MassHunter BioConfirm pro dekonvoluci a analýzu spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Afinitní purifikace na Agilent AssayMAP Bravo poskytla vysoce čisté intaktní protilátky bez pozorovatelných kontaminant z CHO kultury.
• LC/Q-TOF spektra intaktních mAb vykázala přesné neutralní hmotnosti (Herceptin 148 062.20 Da; NIST mAb 148 040.02 Da) s odchylkami do 4 ppm.
• On-cartridge PNGase F deglykozylace vedla ke vzniku mAb beze zbytkových glykanů (o +3 Da oproti teoretické hmotnosti) a rozlišení obou řetězců po redukci s vysokou hmotnostní přesností (LC ~23 439 Da, HC ~49 153 Da).
• On-cartridge proteolytický štěp IdeS uvolnil fragmenty Fc a F(ab')2, které byly separovány a identifikovány: Fc ~25 232 Da, F(ab')2 ~97 630 Da, Fd' a LC fragmenty s adekvátní hmotnostní přesností a rozlišením různých disulfidových forem.
• Workflow snížil dobu přípravy čtyř sad vzorků na ~5,5 hodiny ve srovnání s >1 dnem manuální práce, při zachování vysoké reprodukovatelnosti a snížení lidské chyby.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená produktivita a konzistence analýz díky automatizaci všech klíčových kroků přípravy vzorku.
• Komplexní charakterizace mAb (intaktní forma i podjednotky) v jednom integrovaném workflow.
• Vysoká přesnost hmotnostní analýzy umožňuje detekci a kvantifikaci modifikací jako glykany či nežádoucí addukty.
• Metoda je plně škálovatelná pro rutinní kontrolu kvality (QA/QC) i výzkumné účely.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších enzymatických modulací (např. endo H) pro detailní mapování glykanových populací.
• Implementace vysokopropustného nasazení pro screening rozsáhlých škál variant protilátek.
• Rozšíření platformy o iontovou mobilitu pro lepší separaci izobarických forem a úplnou charakterizaci vzorků.
• Vývoj sofistikovaných softwarových řešení pro automatickou identifikaci PTM a sekvenční validaci.

Závěr

Platforma Agilent AssayMAP Bravo v kombinaci s UHPLC/Q-TOF a softwarovým nástrojem MassHunter BioConfirm poskytuje robustní, automatizované a rychlé řešení pro komplexní hmotnostní charakterizaci monoklonálních protilátek v intaktní i subjednotkové formě. Workflow zkracuje dobu analýzy, zvyšuje reprodukovatelnost a umožňuje detailní studium posttranslačních modifikací.

Reference

1. Chames P., Baty D. Bispecific antibodies for cancer therapy. mAbs. 2009;1(6):539–547.
2. Wang D.L. et al. Precise characterization of intact monoclonal antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies Application Note. 2017;5991-7813EN.
3. Beck A., Wagner-Rousset E. Characterization of therapeutic antibodies and related products. Anal. Chem. 2013;85(2):715–736.
4. Zhang Q., Bateman K.P. Automated DBS microsampling, microscale automation and microflow LC-MS for therapeutic protein PK. Bioanalysis. 2016;8(7):649–659.